廣玉蘭葉、花總黃酮提取方法與含量比較

蔣新龍

(浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015)

廣玉蘭 (Magnolia grandifore)，系木蘭科木蘭屬喬木樹種。原產北美，現作為觀賞植物在我國各地大量栽培。其葉及花中含有揮發油、木蘭花堿等多種化學成分，藥理實驗表明對正常或麻醉狀態下的動物有緩慢的降壓作用［1-2］。其花蕾的醇提物具有明顯的擴張血管降壓作用，并對血小板聚集與血栓形成有抑制作用，可能與其黃酮成分有關［3］。王琪等［4］用微波法進行木蘭屬植物花蕾總黃酮含量測定和提取工藝研究，我們曾用醇提法進行廣玉蘭花總黃酮提取工藝研究［5］，張斌等［6］用醇提法進行廣玉蘭葉總黃酮提取工藝研究，但對廣玉蘭花和葉用微波法和常規浸提法提取總黃酮的對比研究很少。本實驗探討微波提取和醇提取法對廣玉蘭葉花中總黃酮類化合物的提取效果，并對其含量作對比。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮廣玉蘭葉和花采自浙江樹人大學生物與環境工程學院校園，經60℃烘干、粉碎過0.42 mm(40目)篩備用。蘆丁標樣購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。其它試劑均為分析純。

儀器有GZX-91400MBE電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);7200型紫外可見分光光度計 (上海尤尼柯儀器有限公司);M700型美的微波爐 (廣東美的微波爐制造有限公司);FW80高速萬能粉碎機 (天津泰斯特儀器有限公司);AL204電子分析天平 (梅特勒托利多儀器上海有限公司);HH-S11-4-S型電熱恒溫水浴鍋(上海悅豐儀器儀表有限公司);RE540旋轉蒸發(日本)。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮測定的標準曲線

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量。

標準液配置和標準曲線［7］。將蘆丁于120℃干燥至恒重，準確稱取蘆丁標樣20 mg，用80%乙醇溶解，完全轉入100 mL容量瓶，用80%乙醇定容搖勻，得質量濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。取5支 10 mL比色管，分別精密加入 1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL蘆丁標液，各加80%乙醇至5 mL，加入5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻，再放置6 min，加入4%NaOH溶液4 mL，搖勻，放置10 min，以不加黃酮提取液為空白對照，用1 cm比色皿，在7200型可見分光光度計 (500 nm)上測定吸光度A，用最小二乘法作線形回歸曲線，得蘆丁質量濃度C(mg)與吸光度A的關系式為:C=0.650 3 A+0.010 32，其線性范圍為0～1.0 mg，相關系數0.999 7。

測定波長的選擇［8］。取蘆丁標準品和樣品按《中國藥典》2005年版一部中蘆丁測定方法顯色后做全波長掃描，結果顯示在500 nm處有吸收，故確定500 nm為測定波長。

1.2.2 廣玉蘭葉中總黃酮化合物的提取和測定

準確稱取幾份樣品葉的干燥粉末0.500 0 g，加入一定量的乙醇溶液，分別用微波、索氏醇提等方法提取，經過濾或離心分離后，收集提取液，定容到50 mL，精密吸取黃酮提取液1.0 mL于10 mL比色管中，按1.2.1節測定總黃酮類含量的方法，在500 nm下測吸光度值［9］。代入回歸方程，求出提取液中黃酮類化合物含量，同時做3次平行實驗，按下式計算總黃酮含量 (%):C×V×10-3×100/所用原料重量。

式中:C為回歸方程計算所得值;V為提取液總體積 (即定容體積);所用原料重量單位g。

微波提取法:準確稱取幾份樣品葉的干燥粉末0.500 0 g至錐形瓶中，分別對不同的提取微波功率 (144、288、464、648和 800 W)、提取時間(2、3、4、5、6和 7 min)、提取劑濃度 (20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和 90%)、料液比 (1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)等條件做單因素平行實驗。

表1結果表明:0.500 0 g樣品葉的干燥粉末置于錐形瓶中，加入體積分數70%的乙醇25 mL，密閉放入微波爐中，648 W火力下處理1 min，冷卻，過濾，洗滌殘渣，濾液并入容量瓶，以體積分數為70%的乙醇定容到50 mL即得黃酮提取液，在此條件下，廣玉蘭葉中黃酮化合物的含量最高，為2.15%。

表1 微波提取法和索氏回流提取法的效率比較

索氏回流提取法:準確稱取幾份樣品葉的干燥粉末0.500 0 g至錐形瓶中，分別對不同的提取溫度 (40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃)、提取時間 (15、30、45、60、90、120、150和180 min)、提取劑濃度 (20%、30%、40%、50%、60% 和 70%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)等條件做單因素平行實驗。

結果 (表1)表明:0.500 0 g樣品葉的干燥粉末置索氏提取器中，用石油醚脫脂揮干，再用體積分數為50%乙醇20 mL在80℃下抽提2.5 h，提取液濃縮、干燥，然后用體積分數為50%乙醇溶解，并定容至50 mL即得黃酮提取液，在此條件下，廣玉蘭葉中黃酮化合物的含量最高，為1.63%。

比較發現，微波法提取液的最高吸光度是索氏回流法的1.32倍，而且速度快、設備簡單。為此，選用微波法提取樣品的總黃酮。

廣玉蘭花中總黃酮化合物的提取和含量測定方法同上，實驗結果也相似，索氏回流法和微波法所得黃酮分別為5.47%和6.92%。

1.2.3 廣玉蘭花、葉總黃酮微波正交提取

根據1.2.2單因素平行試驗的結果，采用正交試驗設計，應用L9(34)正交表，對提取劑、微波功率、提取時間、提取劑用量4因子在3個水平進行優選 (表2)。結果采用直觀分析和方差分析。

1.2.4 廣玉蘭花、葉總黃酮含量的測定與比較

以正交優先的最佳條件提取總黃酮，分別按1.2.2方法進行黃酮含量測定并比較廣玉蘭花、葉中總黃酮含量的相對大小。

1.2.5 回收率實驗

取5個10 mL比色管，在已知黃酮含量的廣玉蘭葉和廣玉蘭花提取液中分別加入0.2 mg·mL-1蘆丁對照品溶液 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL樣液，分別測定黃酮含量，根據所得的總黃酮含量減去加入的標量，再除以樣品所含的總黃酮量算出回收率。

2 結果與分析

2.1 廣玉蘭花、葉總黃酮微波正交提取

各試驗號根據具體給定的提取條件所得的提取液，用相應提取劑分別定容于50 mL容量瓶中，根據樣品測定方法進行測定并計算黃酮含量。

結果 (表2)表明，廣玉蘭花葉總黃酮的微波正交試驗結果非常相似，在正交試驗的4個因子中，以提取劑對提取率的影響最大;由極差數據K可見，各因子對提取率的影響依次為提取劑＞微波功率＞提取料液比＞提取時間。綜合分析正交試驗結果，確定最佳工藝條件為 A2B2C3D1，即提取劑用70%乙醇溶液，料液比1∶40(g·mL-1)，提取時間50 s，微波功率為800 W。這與1.2.2中微波法單因素平行實驗結果不完全一致，可能是微波功率、提取料液比、提取時間3個影響因子之間存在交互作用。但最佳提取劑均為70%乙醇，此與實驗數據的方差分析結果一致，因為因子A為顯著性因子 (葉 F=22.860 0*，花 F=36.667 9*)，其它因子為不顯著因子。

2.2 廣玉蘭的花、葉總黃酮含量測定與比較

表2 不同處理組合的黃酮含量

以正交優先的最佳條件提取總黃酮，按1.2.2方法進行黃酮含量測定，重復3次，得出廣玉蘭花的平均總黃酮含量為6.92%、葉為2.15%，與原試驗結果基本一致。

2.3 回收率

從表3、表4可知，5個回收率實驗結果的平均值為99.75% ～100.39%，RSD小于2%，說明微波法回收率高。所以，微波法是提取和測定廣玉蘭葉、花總黃酮的最佳方法。

表3 廣玉蘭葉的回收率

表4 廣玉蘭花的回收率

3 小結與討論

采用微波法提取廣玉蘭葉和花的總黃酮，速度快、收率高、設備簡單，提取效果明顯優于傳統索氏回流提取法。最佳提取條件為1∶40(g·mL-1)的70%乙醇水溶液，微波功率800 W，提取時間50 s。

廣玉蘭葉、花中總黃酮含量較高。這與不同部位影響黃酮在植物體內合成、轉化、降解的諸多因素有關［10-11］。花的總黃酮含量高于葉片，而廣玉蘭葉花資源豐富，具有潛在的研究與開發價值。

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