金櫻子對糖尿病鼠肝氧化應激的影響

許金華 秦振啟 周鈺娟 羅玉平 張秋菊

金櫻子(RosaLaevigataMickx)，又稱為刺梨子、刺榆子，入藥歷史悠久。我們課題組研究發現，用含有金櫻子的飼料喂養糖尿病大鼠后，血糖、血脂降低，并能減輕糖尿病時腎病的發生與發展［1］。本實驗進一步研究金櫻子抗氧化應激的作用機理，檢測金櫻子對實驗性糖尿病大鼠肝臟的IKK/IκB/NF-κB信號通路中下游單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、核轉錄因子(NF-κB)表達的影響，為防治糖尿病提供新依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只雄性SD大鼠購自南華大學實驗動物部(許可證:SYXK(湘)2004-0011)，約2月齡，體重為(250 ±20)g，適應性飼養1周。

1.2 藥品與試劑 金櫻子干果購自衡陽市藥材公司，去蒂和雜質，曬干，用電動粉碎機輾成粉末過篩去粗粒，按每只鼠每天40g鼠普通飼料加生藥粉(5g/kg·bw·d)制成加藥顆粒飼料。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司;MCP-1抗體、NF-κB抗體購自武漢博士得生物工程公司;其余試劑均為國產分析純試劑。高糖高脂飼料為蔗糖10%、豬油10%，奶粉7%、雞蛋10%、普通飼料63%。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立 按體重隨機取50只雄性SD大鼠，禁食不禁水12h后，參照洪麗莉等［2，3］的方法并加以改進建立糖尿病模型:按25mg/kg·bw劑量空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素(STZ)溶液。STZ臨用前用枸櫞酸鈉緩沖液(0.1mol/L，pH4.2)配制，10min內用完。飼喂高糖高脂飼料，自由飲水。注射STZ后，于第3、6、15天禁食不禁水過夜后測血糖，3次血糖值均大于11.3mmol/L者為造模成功。從中挑選40只按體重隨機分為兩組:糖尿病模型組(模型組)和金櫻子干預組(干預組)，每組20只。未注射STZ的40只雄性SD大鼠，按體重隨機分為正常對照組(正常組)和金櫻子對照組(對照組)，每組20只，腹腔內注射等量枸櫞酸鈉溶液。

糖尿病模型組飼喂高糖高脂飼料，金櫻子干預組飼喂高糖高脂加金櫻子的飼料，正常對照組飼喂普通飼料，金櫻子對照組飼喂加金櫻子的普通飼料。連續給藥24周。24周后按33mg/kg·bw的劑量腹腔注射水合氯醛麻醉處死大鼠，取部分肝組織用消毒的冰冷生理鹽水洗凈血液，立即入-80℃冰箱保存待測MCP-1、NF-κB的蛋白表達。

1.3.2 檢測MCP-1、NF-κB的蛋白表達 免疫組化SP法:將石蠟切片常規脫蠟，水化后，用PBS沖洗3次，每次5min;每張切片加一滴過氧化酶阻斷劑(試劑A)，室溫下孵育10min;再用PBS洗3次后，滴加非免疫性動物血清(試劑B)，37℃孵育5min;棄去非免疫性動物血清;滴加一抗，4℃過夜;PBS洗3次后再滴加二抗(試劑C)，37℃孵育10min;PBS洗3次后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶溶液(試劑D)，37℃孵育10min;PBS洗3次后，用新鮮配制的DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察2～5min;自來水沖洗，蘇木素淺染，自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片;利用圖像分析系統進行灰度掃描分析。

1.4 統計學分析 用SPSS13.0統計軟件進行數據處理，采用方差分析，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

從圖1-圖2可看出，正常組MCP-1、NF-κB表達于胞漿質中，可見肝細胞質中散在分布少量淺黃色顆粒。模型組MCP-1、NF-κB的表達增強，細胞質中棕黃色顆粒增多，肝細胞核出現棕黃色陽性著色;干預組肝細胞質中散的分布淺黃色顆粒少。灰度掃描結果顯示，金櫻子干預組MCP-1、NF-κB蛋白的表達低于糖尿病模型組(P＜0.05);金櫻子對照組MCP-1、NF-κB蛋白的表達與正常對照組比較無差異(P＞0.05)。

圖1 MCP-1蛋白的表達結果

圖2 NF-κB蛋白的表達結果

3 討論

氧化應激(OxidativeStress，OS)，就是由于某種或多種原因而破壞了機體內強氧化劑和抗氧化劑的平衡導致的潛在傷害。現在，氧化應激被認為是造成糖尿病及其并發癥、肺纖維化、癲癇、高血壓、動脈粥樣硬化、癌癥、腎病變和帕金森癥等疾病的重要原因。目前研究認為，糖尿病及其并發癥的發生、發展和病情程度與自由基引發和介導的機體氧化損傷和機體抗氧化防御系統清除自由基能力的平衡失調密切相關［4］。

研究表明肝臟中的IKK/IκB/NF-κB信號通路，在糖尿病發生和肝臟的炎癥過程中起到了重要作用，機體受到如:活性氧自由基(ROS)等刺激，IKK-β被活化，被活化的IKK-β使IκB-α發生磷酸化，IκB-α的磷酸化使得其被蛋白酶小體快速降解泛素化降解，從而使得原本與 IκB-α結合的NF-κB游離出來，進入細胞核，啟動炎癥因子如:MCP-1等基因的轉錄。進而引發了胰島素抵抗和肝臟的炎癥［5，6］。胰島素抵抗發生時，肝細胞內出現活性氧族應激反應，由于三酰甘油在肝細胞內蓄積，大量的游離脂肪酸在線粒體內氧化，產生了過多的超氧陰離子和ROS，使抗氧化物質耗竭。因此，活性氧和許多自由基不能完全代謝。而過多的ROS又可損傷線粒體，導致更多的ROS生成。ROS還可以激活肝臟中IKK/IκB/NF-κB信號通路，導致肝臟過多的表達和分泌炎癥細胞因子如:TNF-α、IL-1、IL-6 和 MCP-1 等［6］。

本研究采用高糖高脂和腹腔注射STZ相互結合的方法構建二型糖尿病模型，結果發現金櫻子能抑制糖尿病大鼠肝臟 MCP-1、NF-κB蛋白的表達，明顯緩解糖尿病大鼠的氧化應激，顯著增強其機體抗氧化能力，從而為防治糖尿病提供了新依據。

［1］周鈺娟，廖前進，張秋菊，等.金櫻子對大鼠糖尿病腎臟的實驗研究.南華大學學報(醫學版)，2007，35(3):332-335.

［2］洪麗莉，許冠蓀，申國明，等.SD大鼠2型糖尿病模型的建立.中國比較醫學雜志，2005，15(6):379-381.

［3］Luo J，Quan J，Tsai J，et al. Nongenetic mouse models of Non-InsulinDependent Diabetes Mellitus. Metabolism，1998， 47 ( 6 ) :663-668.

［4］Maritim A C，Sanders R A，Watkins J B Ⅲ. Diabetes，oxidativestress，and antioxidant: a review. J Biochem Mol Toxical，2003，17( 1) : 24-38.

［5］Arkan MC，Hevener AL，Greten FR，Maeda S. IKK-beta links inflammationto obesity-induced insulin resistance. Nat Med，2005，11( 2) : 191-198.

［6］Boden G，She P，Mozzoli M，et al. Free fatty acids produce insulinresistance and activate the proinflammatory nuclear factor-kappaBpathway in rat liver. Diabetes，2005，54( 12) : 3458-3465.