胃癌組織 PTEN基因的表達及其與 MMP-9的相關性

覃月秋 黃贊松 何守搞 周喜漢

(右江民族醫學院附屬醫院消化內科,廣西 百色 533000)

與細胞支架蛋白 tensin同源在 10號染色體有缺失的磷酸酯酶(PTEN)是近年發現的第 1個具有磷酸酶活性的抑癌基因〔1〕。它能通過對酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸脫磷酸化作用調控細胞內多種信號傳導通路,從而調節細胞的生長、發育,誘導細胞凋亡,調控細胞周期以及抑制腫瘤細胞黏附、轉移。研究發現,PTEN基因突變、缺失及異常表達與人類多種惡性腫瘤的發生、發展及預后密切相關〔1～3〕。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)能降解基膜和細胞外基質中的Ⅳ型膠原成分,為惡性腫瘤的浸潤、轉移及腫瘤間質血管的新生提供有利條件〔4〕。關于PTEN基因對轉移相關酶 MMP-9的調節機制國外已有少量文獻報道。本研究通過檢測抑癌基因PTEN在胃癌中的表達,觀察其與胃癌臨床病理因素的關系及與 MMP-9蛋白表達的相關性,探討 PTEN基因在胃癌發生、發展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 57例原發性胃癌及癌旁正常組織取自本院 1999至 2002年經病理證實的手術切除標本蠟塊或活檢組織,患者術前均未經放療和化療。57例癌組織中,男性 39例,女性 18例,年齡 30～75歲,平均(49±5.35歲)。按分化程度:低分化癌 39例,高分化、中分化癌 18例。癌轉移情況:有淋巴結轉移32例,無淋巴結轉移 25例;遠處轉移 7例,無遠處轉移 50例。胃癌浸潤深度:浸潤未超過漿膜層(T1+T2)22例,浸潤超過漿膜層(T3+T4)35例。TNM分期:Ⅰ期 13例,Ⅱ期 11例,Ⅲ期24例,Ⅳ期 9例。

1.2 方法 每例取原發灶癌組織、切緣正常組織及轉移淋巴結,組織經 10%甲醛固定,石蠟包埋,4μm連續切片,分別進行HE染色和免疫組化S-P法染色(操作按試劑盒說明書進行)。鼠抗人 PTEN單克隆抗體及鼠抗人 MMP-9單克隆抗體均為Santa Cruz公司產品。S-P試劑盒購自福州邁新生物公司。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判斷 PTEN和MMP-9蛋白染色陽性反應信號呈棕黃色細小顆粒,定位于胞漿。在高倍鏡(×400)下每張切片至少 5個隨機視野中計數 500個細胞,計算陽性細胞數的百分比。按切片中陽性細胞率及染色反應強度分為 4級:陰性(-):細胞內不著色或陽性細胞率 ＜10%;弱陽性(+):細胞內出現淺棕色顆粒和(或)陽性細胞率為 10%～29%;陽性(?):細胞內出現棕黃色顆粒和(或)陽性細胞率為 30% ～60%;強陽性(?):細胞內出現深棕黃色顆粒和(或)陽性細胞率 ＞60%。

1.4 統計學處理 采用SPSS10.0統計軟件對數據進行χ2檢驗及 Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織中 PTEN蛋白和 MMP-9蛋白的表達 PTEN蛋白染色陽性反應信號呈棕黃色細小顆粒,位于細胞質。胃癌組織中PTEN蛋白表達的陽性率 61.4%(35/57)顯著低于癌旁正常胃黏膜 100%(57/57)(P＜0.01)。MMP-9蛋白染色陽性反應信號呈棕黃色細小顆粒,位于細胞漿。癌組織 MMP-9蛋白表達的陽性率 73.7%(42/57)明顯高于相應正常組織 19.3%(11/57)(P＜0.01)。

2.2 胃癌中 PTEN和 MMP-9蛋白表達的相關性 胃癌中PTEN蛋白的表達強度與 MMP-9蛋白的表達強度呈負相關(rs=-0.462,P＜0.01),隨著 PTEN蛋白表達強度的增加,MMP-9蛋白表達強度減弱,反之亦然。見表 1。

表1 胃癌組織PTEN和MMP-9蛋白表達的相關性

2.3 胃癌組織PTEN蛋白和 MMP-9蛋白表達與臨床病理特征的關系 TNM分期Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織 PTEN蛋白表達水平低于Ⅰ、Ⅱ期胃癌組織(P＜0.01);低分化癌組織PTEN蛋白的表達低于高分化、中分化癌組織(P＜0.01);有淋巴結轉移的胃癌組織PTEN蛋白表達低于無淋巴結轉移的胃癌組織(P＜0.05),胃壁浸潤程度越深表達越低。而 MMP-9蛋白表達水平則隨胃壁浸潤深度增加、淋巴結轉移及 TNM分期的進展而增高。見表 2。

表2 胃癌及癌旁正常組織PTEN和MMP-9蛋白的表達

3 討 論

PTEN基因〔1～3〕(又稱 MMAC1或 TEP1)由 3個研究小組于1997年發現并命名,因該基因在人類多種腫瘤中存在突變、缺失及異常表達,被認為是繼p53基因之后發現的又一重要抑癌基因。PTEN基因定位于 10q23.3,全長約 200 kb,由 9個外顯子和 8個內含子組成。其氨基端(N端)磷酸酶區域為主要功能區,該區第 122～133位氨基酸序列內有雙特異性磷酸酶(DSP)催化區的核心基序 HCXXGXXTS/T,對酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸有脫磷酸化作用,既可通過脂質磷酸酶活性調節細胞生長和凋亡,也可利用蛋白磷酸酶活性抑制細胞黏附和轉移。

最近的研究證明消化道腫瘤中存在該基因的缺失、突變或異常表達。Tachibana等〔5〕用免疫組化法檢測 97例食管癌,其中 PTEN蛋白陽性表達率 49.5%,陰性表達率 50.5%,且 PTEN表達與腫瘤 TNM分期、患者存活率明顯相關。Yang等〔6〕檢測了胃癌組織及鄰近正常胃黏膜組織、腸化生、不典型增生組織中 PTEN蛋白表達的情況,結果正常胃黏膜組織及腸化生組織中 PTEN蛋白表達的陽性率(分別為 100%、98.5%)明顯高于不典型增生(66.7%)及胃癌組織(47.8%)(P＜0.01)。本研究結果提示,①PTEN蛋白失表達促進了胃癌的發生、發展,檢測 PTEN蛋白的表達可作為胃癌發生的監測指標之一。②PTEN蛋白的表達與胃癌的組織分化程度呈正相關:組織分化程度高、惡性程度低者,PTEN蛋白表達的陽性率高;而 PTEN蛋白失表達或弱陽性表達則多見于組織分化程度低、惡性程度高者。③PTEN蛋白的表達隨胃壁浸潤深度增加、淋巴結轉移及TNM分期的進展而降低,說明 PTEN蛋白失表達在胃癌的增殖、浸潤、轉移等過程中起到了促進作用,PTEN蛋白的檢測,有可能為判斷胃癌的惡性程度及患者的預后提供線索。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一種重要的蛋白水解酶。能降解細胞外基質,參與胎兒發育過程中的組織重構和傷口愈合過程中的膠原重構等生理過程。在病理情況下,MMPs一方面通過降解基底膜和包繞腫瘤的基質,突破基質屏障,促進腫瘤浸潤、轉移,另一方面則通過毛細血管增生,新生血管生成等促進腫瘤生長、擴散〔7〕。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族成員之一,可降解細胞外多種基質成分,如Ⅳ型膠原、蛋白多糖、層黏蛋白及纖維連接蛋白等,在腫瘤浸潤、轉移過程中發揮極其重要的作用〔8,9〕。 Torii等〔10〕檢測了 70例胃癌患者和 130例正常人MMP-9的表達,結果發現胃癌組織 MMP-9高于正常組織,且與腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度及 TNM分期有關。本研究結果提示胃癌組織中存在 MMP-9的過度激活。與 Torii等〔10〕的研究結果一致。表明胃癌組織分泌MMP-9降解了基底膜和細胞外基質,促進了腫瘤細胞向周圍組織浸潤,是反映胃癌惡性進展的一個比較可靠的指標。

抑制腫瘤細胞的浸潤、轉移是 PTEN基因的重要生物學功能之一,關于 PTEN基因對轉移相關酶MMP-9的調節機制國外已有少量文獻報道。Moon等〔11〕研究發現,轉錄因子 NF-kappaB和活化蛋白-1(AP-1)能調節 MMP-9啟動子的轉錄,而PTEN基因通過抑制 NF-kappaB和 AP-1的作用,使 MMP-9啟動子的轉錄活性顯著降低,MMP-9蛋白合成及表達減少。Park等〔12〕發現,在成膠質瘤細胞系 U87MG、U251MG和 U373MG中,PTEN基因的失活促進透明質酸酶誘導的 MMP-9分泌;而野生型 PTEN表達的成膠質瘤細胞系 LN229、LN18和 LN428中并無類似現象。此外,把野生型 PTEN導入U87MG細胞系后,透明質酸酶誘導的MMP-9分泌顯著減少。這說明,通過阻斷透明質酸酶誘導的 MMP-9分泌而抑制腫瘤細胞的浸潤、轉移是PTEN基因的作用機制之一。本研究結果說明 PTEN基因低表達或失表達可能導致了 MMP-9的過度激活,促進腫瘤浸潤、轉移。研究兩者的關系有助于闡明PTEN基因的作用機制及胃癌轉移的分子機制,為開辟腫瘤治療新途徑打下理論基礎。

用免疫組化法檢測胃黏膜組織 PTEN基因及 MMP-9的表達簡便、快速,既可為胃癌早期診斷提供線索,又有助于判斷預后。在治療上,對患者給予化學干預治療,促進 PTEN基因表達,抑制MMP-9表達,有可能阻斷或逆轉癌前病變,抑制胃癌轉移,降低患者死亡率,這將為胃癌治療提供極富吸引力的前景。

1 Li J,Yen C,Liaw D,et al.PTEN,a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain,breast,and prostate cancer〔J〕.Science,1997;275(5308):1943-7.

2 Steck PA,Pershouse MA,Jasser SA,et al.Identification of a candidate tumour suppressor geng,MMAC1,at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers〔J〕.Nat Genet,1997;15:356-2.

3 Li DM,Sun H.TEP1,encoded by a candidate tumor suppressor locus,is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor β〔J〕.Cancer Res,1997;57:2124-9.

4 Cornelius LA,Nehring LC,Roby JD,et al.Human dermal microvascular endothelial cells produce matrix metalloproteinases in response to angiogenic factors and migration〔J〕.J Invest Dermatol,1995;105(2):170-6.

5 Tachibana M,Shibakita M,Ohno S,et al.Expression and prognostic significance of PTEN product protein in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Cancer,2002;94(7):1955-60.

6 Yang L,Kuang LG,Zheng HC,et al.PTENencoding product:a marker for tumorigenesis and progression of gastric carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol,2003;9(1):35-9.

7 Kleiner DE,Stetler-Stevenson WG.Matrix metalloproteinases and metastasis〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,1999;43(suppl):S42.

8 Aznavoorian S,Murphy AN,Stetler-Stevenson WG,et al.Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis〔J〕.Cancer,1993;71(4):1368-83.

9 Ramos-DeSimone N,Hahn-Dantona E,Sipley J,et al.Activation of matrix metal lipoproteinase-9(MMP-9)via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion〔J〕.J Biol Chem,1999;274(19):13066-76.

10 Torii A,Kodera Y,Uesaka K,et al.Plasma concentration of matrix metallipoproteinase 9 in gastric cancer〔J〕.Br J Surg,1997;84(1):133-6.

11 Moon SK,Kim HM,Kim CH.PTEN induces G1 cell cycle arrest and inhibits MMP-9 expression via the regulation of NF-kappaB and AP-1 in vascular smooth muscle cells〔J〕.Arch Biochem Biophys,2004;421(2):267-76.

12 Park MJ,Kim MS,Park IC,et al.PTEN suppresses hyaluronic acid-induced matrix metalloproteinase-9 expression in U87MG glioblastoma cells through focal adhesion kinase dephosphorylation〔J〕.Cancer Res,2002;62(21):6318-22.