化瘀理肺方對大鼠肺纖維化形成的干預作用及對 Smad7表達的影響

李 飛 劉世青 黃曉日 李長生 時衍同 孫 清 劉 群 孫德剛 鹿 偉 李 霞

(日照市人民醫院,山東 日照 276800)

肺纖維化是一種漸進性致死性疾病,發病機制尚不完全明確,目前對于肺纖維化的治療主要是基于抑制炎癥可阻止肺纖維化進展這一觀念,一般采用激素治療,但療效甚微,僅對 20%的肺纖維化患者有效,而且常常為一過性反應〔1〕,應用免疫抑制劑或細胞毒類藥物對某些肺纖維化病人作為第二線藥物用于治療,不僅存在潛在的嚴重副作用,而且對肺纖維化治療基本無效。化瘀理肺方是以“化瘀理肺、暢利氣機”為治則組成的中藥方劑,本課題擬通過動物實驗研究化瘀理肺方對大鼠肺纖維化模型的干預作用,并用組織芯片和免疫組化相結合的辦法檢測 Smad7蛋白表達,探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性 Wistar大鼠 44只,體重(180～220)g,清潔級,由山東大學試驗動物中心提供,動物合格證號為 ssxk(魯)20030004。動物隨機分為 4組:模型組(博萊霉素 +生理鹽水)、中藥組(博萊霉素 +化瘀理肺方)、激素組(博萊霉素 +氫化可的松琥珀酸鈉)、對照組(生理鹽水 +生理鹽水),中藥組 14只,其余每組 10只。

1.2 藥品與試劑 化瘀理肺方由丹參、半夏、當歸、水蛭、黃芪、補骨脂、薏苡仁、魚腥草、地龍等組成,所用中藥為濃縮顆粒劑,由江陰天江藥業有限公司生產,生產批號為 0509025,經溶解配成含生藥 1 341 mg/ml的溶劑,高壓滅菌,4℃冰箱保存備用;注射用鹽酸博萊霉素(15 mg/支)由日本化藥株式會社生產,產品批號為 950330,使用時以生理鹽水配成 1 mg/ml;氫化可的松琥珀酸鈉(50 mg/支)購自天津市生物化學制藥廠,產品批號為 20060301;Smad7抗體(0.2 ml,200μg/ml)及鏈霉親和素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 模型的建立與標本處理 用 1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔內注射麻醉,固定四肢及頭部,在額鏡直視下,將與 1ml注射器相連的帶接頭硬脊膜外麻醉導管插入氣管,注入 0.4%博萊霉素 0.25 ml(5 mg/kg),對照組注入生理鹽水 0.25 ml作為正常對照,注藥后立即將動物直立旋轉,使藥物在肺內分布均勻。次日開始,中藥組每天給予化瘀理肺方藥物灌胃(13 410mg/kg),激素組每天給予氫化可的松琥珀酸鈉腹腔注射(25mg/kg),對照組和模型組每天給予生理鹽水(2 ml/只)灌胃。給藥后第 14和 28天每組各處死 5只大鼠(中藥組處死7只),取右肺中葉置于 10%中性甲醛固定,石蠟包埋、切片,HE染色。

1.4 組織芯片的制作 按劉衛平等〔2〕的方法制作組織芯片,具體步驟如下:制作空白石蠟塊,根據樣本的數量在空白石蠟塊上鉆孔 (選用鉆頭的直徑約 2 mm),在HE染色切片上選取具代表性的部位并標記,再用金屬空心管(內徑約 2 mm)從經定位的目標石蠟塊上鉆取組織,并轉移到已鉆孔的空白石蠟塊的相應位置,將蠟塊置 40℃烤箱內數天,使組織與石蠟充分融合,按常規方法連續切片,厚 4μm,裱于 10%多聚賴氨酸處理的載玻片上,56℃烤片 3h以上,供免疫組化染色。

1.5 免疫組化染色 免疫組化染色采用鏈霉親和素-生物素-酶復合物(SABC)法進行,具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 觀測指標

1.6.1 肺泡炎、肺纖維化程度判斷 HE切片按 Szapiel等〔3〕的方法確定肺泡炎和肺纖維化的程度:(1)肺泡炎分級:0級:無肺泡炎(-);1級:輕度肺泡炎(+),受累面積小于全肺20%;2級:中度肺泡炎(?),占 20%～50%;3級:重度肺泡炎(?),受累面積大于 50%。(2)肺間質纖維化分級:0級:無肺間質纖維化(-);1級:輕度肺間質纖維化(+),病變范圍局限在全肺 20%以下;2級:中度肺間質纖維化(?),病變范圍占全肺 20%～50%;3級:重度肺間質纖維化(?),病變范圍大于50%,肺泡融合,肺實質結構紊亂。 -為 0分,+為1分,?為 2分,?為 3分,將等級資料轉化為計量資料。

1.6.2 免疫組化染色程度判斷 免疫組化染色以細胞中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性反應。半定量判定根據 Wilentz等〔4〕的標準略做修改:染色強度A:無色、淡黃、棕黃、棕褐分別計為0、1、2、3分;染色廣度 B:陽性細胞數占總細胞數的百分比;A、B兩項所得相乘所得數值為免疫組化染色指數。

1.7 統計學處理 采用 SPSS13.0軟件,數據以 x±s表示。同一時間點的 4個組進行單因素方差分析,并用 q檢驗進行不同組間的兩兩比較。

2 結 果

2.1 組織病理形態學改變

2.1.1 大體觀察 對照組大多雙肺外觀無異常,肺葉輪廓清晰,表面光滑、粉紅色、彈性良好;第 14天有 1只大鼠肺葉呈淡紅色,但無結節樣改變。模型組第 14天雙肺膨大,紅色,可見散在點狀暗紅色出血,局部見大小不等灰白色結節樣改變,彈性差;第 28天雙肺較前體積縮小,硬度增加,表面結節樣改變、串珠狀充氣空泡及條索狀凹溝。中藥組部分呈暗紅色,偶見大小不等結節樣改變、邊緣有點狀出血及部分肺葉體積縮小。激素組與模型組相似,部分肺葉表面光滑,局部見大小不等結節樣改變,邊緣有點狀出血,部分肺葉體積縮小,有白色結節。

2.1.2 光鏡觀察 對照組大鼠大多肺結構清晰,觀察各時間段未出現明顯形態學改變,極少數出現肺泡間隔增寬及少量炎性細胞浸潤情況。模型組第 14天肺泡間隔明顯增寬,可見大量炎性細胞浸潤的改變,伴成纖維細胞增多;第 28天肺泡結構破壞,肺泡間隔增寬及肺間質纖維成分增多較前更為明顯,毛細血管腔明顯增厚,個別閉塞,但肺部炎性細胞浸潤情況較前有所減輕(見圖 1)。激素組和中藥組肺泡炎程度同模型組比較均明顯減輕(P＜0.05或P＜0.01),且隨著時間演變有繼續減輕趨勢;中藥組肺泡炎減輕程度更為明顯,第 28天時同對照組比較已無統計學意義(P＞0.05)。激素組肺纖維化程度與模型組比較有所減輕,但不明顯(P＞0.05),且仍有繼續加重趨勢;中藥組纖維化程度同模型組比較明顯減輕(P＜0.01),而且肺纖維化發展有減緩趨勢,其中,第 28天時肺纖維化程度同激素組比較也明顯減輕(P＜0.05),但同對照組比較仍較重(P＜0.01)(見表 1)。

圖1 第 28天時各組肺組織病理圖片(HE,×100)

表1 4組大鼠各時間點肺泡炎、肺纖維化程度比較(分,x±s)

圖2 第 28天時各組 Smad7免疫組化染色(DAB,×400)

表2 4組大鼠各時間點Smad7蛋白表達指數(x±s)

2.2 Smad7蛋白的表達 Smad7蛋白在對照組中大量表達,主要定位在肺泡上皮細胞的胞質中,支氣管上皮細胞及少量間質細胞的胞質中也有少量表達,胞核中偶有表達(見圖 2)。模型組Smad7蛋白表達明顯少于對照組(P＜0.01),并且有減少趨勢。激素組 Smad7蛋白表達也顯著少于對照組(P＜0.01),同模型組比較有所增強,但無統計學意義(P＞0.05),而且也有減少的趨勢。中藥組 Smad 7蛋白表達與激素組和模型組比較均明顯增強(P＜0.01),并且有升高趨勢,第 28天已接近正常對照組水平(見表 2)。

3 討 論

目前對于肺纖維化的治療主要是應用激素、免疫抑制劑及細胞毒藥物,但效果尚不能讓人滿意。近年來,辛洪濤〔5〕,蔣云峰〔6〕,李玉盛〔7〕等應用中醫中藥治療肺纖維化取得一定效果。我們在原有中醫防治肺纖維化理論基礎上,深入研究其發病機制,認為肺腎虧虛為發病之本,痰瘀阻絡為發病之標,毒邪是急性發作的誘因、病情加重的條件,以“活血化瘀,祛痰理肺,暢利氣機”為治則組成化瘀理肺方。方中丹參功長活血化瘀生新,通行血脈,半夏燥濕化痰濁,消痞散結,既消已生之痰,又杜生痰之源,二者合用有利于消除絡脈之痰濁瘀血,共為君藥;當歸、水蛭為臣藥,助君藥祛瘀生新、化痰散結、暢利絡脈;黃芪具有補氣升陽、益肺固表之功,補骨脂補腎壯陽,溫脾,治肺腎虛喘,有補腎納氣定喘之功,二藥為伍,補肺氣,攝納腎氣,助陽以化陰,培補后天以養先天,共同輔助君藥,達到氣旺血生,血充氣固,瘀去絡通,百脈流暢,以維持正常氣機的升降出入;薏苡仁、魚腥草、地龍合用為佐藥。全方共奏補肺固表、益腎納氣、逐瘀通絡、暢利氣機之功。

Smad7是轉化生長因子 β(TGF-β)信號轉導途徑的主要抑制性調控蛋白,可以通過抑制TGF-β的信號傳導發揮負調控作用〔8～10〕。在研究中人們發現,阻斷 Smad7內源性表達可促進TGF-β對肺上皮細胞發育的抑制作用〔11〕,經氣管內注入攜帶Smad7基因的重組腺病毒,則能抑制Ⅰ型前膠原 mRNA的表達,降低肺組織羥脯氨酸含量,改善肺組織纖維化程度〔12〕,提示 Smad7蛋白表達情況與肺纖維化關系密切。因而,作為TGF-β活性及肺纖維化的一種重要負向調節劑,Smad7蛋白在抗纖維化治療的研究中日益受到重視。

通過實驗我們發現,造模后第 14天后肺泡間隔明顯增寬,可見大量炎性細胞浸潤的改變,伴成纖維細胞增多,第 28天炎癥有所減輕,但肺間質纖維成分增多較前更為明顯,達到預期造模目標。給予激素干預可明顯減輕肺部炎癥反應,但對博萊霉素引起的肺纖維化模型的纖維化進展干預作用不大,這與目前臨床應用激素治療肺纖維化效果差的現狀相符。經化瘀理肺方干預組大鼠肺部炎癥及纖維化程度均明顯輕于同期模型組,其中第 28天纖維化程度輕于激素組,提示化瘀理肺方對博來霉素引起的大鼠肺纖維化有干預作用。另外,我們利用組織芯片進行免疫組化染色發現,模型組的Smad7蛋白表達明顯減少,且有進行性減少趨勢,造模后第 14天肺纖維化大鼠的Smad7蛋白表達平均水平較對照組減少了 61%,到造模后第28天則減少了 71%,提示Smad7蛋白表達減少可能在博萊霉素致大鼠肺纖維化中起了重要作用;而經化瘀理肺方干預后,Smad 7蛋白的表達明顯增強,其中到第 28天甚至與對照組表達水平相仿,提示化瘀理肺方可能部分通過增強 Smad 7蛋白表達,從而抑制 TGF-β生物活性發揮作用。

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2 劉衛平,張紅英,郭 嘉,等.組織芯片技術及其在病理學研究中的初步應用〔J〕.中華病理學雜志,2002;31(2):179-80.

3 Szapiel SV,Elson NA,Fulmur JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse〔J〕.Am Rev Respir Disease,1979;120(4):893-7.

4 Wilentz RE,Su GH,Dai JL,et al.Immunohistochemical labeling for DPC4 mirrors genetic status in pancreatic adenomas a new marker of DPC4 inactivation〔J〕.Am JPathol,2000;156(1):37-43.

5 辛洪濤,劉慶華,張 欣,等.芪丹顆粒劑治療肺間質纖維化的臨床研究〔J〕.山東醫藥,2002;42(19):20-1.

6 蔣云峰,黃 芪.桃紅湯治療特發性肺纖維化 24例〔J〕.吉林中醫藥,2003;23(11):14.

7 李玉盛,馬淑榮.益氣化纖湯治療特發性肺纖維化 34例〔J〕.實用中醫內科雜志,2006;20(3):282.

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9 Kavsak P,Rasmussen RK,Causing CG,et al.Smad7 binds to smurf2 to form an E3 ubiquitin ligase that targets the TGF-beta receptor for degradation〔J〕.Mol Cell,2000;6(6):1365-75.

10 Shi W,Sun C,He B,et al.GADD34-PP1c recruited by Smad7 dephosphorylates TGF beta type I receptor〔J〕.JCell Biol,2004;164(2):291-300.

11 Zhao J,Crowe DL,Castillo C,et al.Smad7 is a TGF-beta inducible attenuator of Smad2/3-mediated inhibition of embryonic lung morphogenesis〔J〕.Mech Dev,2000;93(1-2):71-81.

12 Nakao A,Fujii M,Matsumra R,et al.Transient gene transfer and expression of Smad7 prevents bleomycin-induced lung fibrosis in mice〔J〕.J Clin Invest,1999;104(1):5-11.