腦益康藥物血清對 D-半乳糖致海馬神經元凋亡的影響

朱 燕 周愛玲 胡亞娥 茅家慧 施海燕

(南通大學醫學院,江蘇 南通 226001)

阿爾茨海默病(AD)是老年人中最常見的神經系統退行性疾病,嚴重危害老年人的身心健康,并給其家庭和社會帶來沉重負擔。目前治療 AD的方法僅能緩解癥狀,不能改變疾病病程,尚無有效預防和治愈措施,因而研究開發有效的藥物成為熱點。近年來,氧化應激和氧自由基在 AD發病中的作用已經被許多體外實驗和臨床研究所證實〔1〕。腦益康(naoyikang,NYK)是由制首烏、知母、巴戟天等組成的中藥復方,具有藥物多靶位作用〔2～4〕。本實驗運用血清藥理學方法制備腦益康藥物血清,采用 D-半乳糖(D-galactose,D-gal)建立AD細胞模型,觀察腦益康藥物血清對 AD細胞模型的保護作用及其機制,為腦益康的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性 SD大鼠,體重(250±10)g;24 h內 SD新生鼠;均由南通大學實驗動物中心提供。合格證號:SYXK(蘇)2002-0022。

1.1.2 藥品與試劑 NYK由南通市中醫院制劑室制成顆粒劑。D-gal(上海恒信化學試劑有限公司);維生素E(VitE,南京白敬宇制藥廠);DMEM培養基(美國 GIBCO公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT,上海實生細胞生物技術有限公司);考馬斯亮藍法測蛋白試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物醫學工程研究所)。PCR引物由上海英駿生物技術服務有限公司合成。

1.1.3 儀器 754型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);核酸蛋白定量監測儀(德國 Biophotometer公司);PTC-100型 PCR儀(美國 MJ.RESEARCH.INC.);小源凝膠圖像分析系統(上海小源科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 NYK藥物血清的制備 雄性 SD大鼠 15只,隨機分為正常對照組、VitE處理組和 NYK處理組,每組 5只。所有動物自由飲水,適度光照。正常對照組:喂養基本飼料觀察 3 d后,用生理鹽水 10.0 ml/kg灌胃。VitE處理組:將 VitE溶于菜油中,配成 0.125%的溶液,按10.0 ml/kg灌胃。NYK處理組:將中藥顆粒加 ddH2O,配成 17.1%的水溶液,按 10.0 ml/kg灌胃(相當于臨床成人用量)。各組大鼠每天灌胃 2次,連續3 d〔5〕,末次灌藥后 1 h頸總動脈取血,4℃過夜,待全血凝固后,2 500 r/min離心 20 min,分離血清,經 56℃,30 min滅活,0.22μm濾膜過濾除菌,-70℃保存備用。

1.2.2 海馬神經元的培養 取新生 24 h的 SD大鼠,無菌條件下取腦,分離雙側海馬,剔除血管,用冰浴 D-Hank′s液洗 2次,剪碎,0.125%胰蛋白酶 2 ml,37℃消化 30 min,每 5 min振蕩 1次。用等體積含 10%胎牛血清的 DMEM終止消化,吹打成細胞懸液,1 000r/min離心 10 min,棄上清,吹打分散細胞,分別經 60目和 200目的篩網過濾。計數后將細胞懸液稀釋至所需密度接種于用 0.1 mg/ml多聚賴氨酸處理的培養板。48 h后加入終濃度為 10μmol/L阿糖胞苷作用 24 h更換新培養液,以后每 2天半量換液,培養 6 d的海馬神經元用于實驗。

1.2.3 分組與處理 將細胞分為正常對照組、模型組、VitE處理組、NYK處理組。正常對照組:培養 6 d的海馬神經元,棄培養液,加入無血清 DMEM和 10%正常大鼠血清培養 24 h。模型組:培養 6d的海馬神經元,棄培養液,加入無血清 DMEM、10%正常大鼠血清和 D-gal(D-gal終濃度為 100 mmol/L〔6〕)培養 24 h。VitE處理組:培養 6 d的海馬神經元,加入無血清DMEM和 10%VitE藥物血清后 1 h,再加入 D-gal培養 24 h。NYK處理組:培養 6 d的海馬神經元,棄培養液,加入無血清DMEM和 NYK藥物血清后 1 h,再加入 D-gal,其中藥物血清分別以 5.0%、10.0%、20.0%稀釋濃度添加〔7〕,培養 24 h。

1.2.4 MTT法檢測NYK藥物血清對D-gal誘導損傷后海馬神經元存活率的影響 常規培養的海馬神經元用含有 10%胎牛血清的 DMEM稀釋成 5×105個/ml,每孔 100μl接種于 96孔培養板中,使各孔細胞數基本相同;培養板的第 1列不接種細胞而每孔只加無細胞 DMEM,作為空白調零孔。培養6 d后,棄培養液,設正常對照組、模型組、VitE處理組、NYK處理組,每組11個復孔。每孔加入 25μl MTT溶液(終濃度 1 mg/ml),孵育4 h,每孔再加入 100μl 20%SDS,繼續孵育 24 h后取出,用酶標儀測定各孔在 570 nm處的光吸收值并計算出細胞存活率。細胞存活率 =實驗組 OD/對照組 OD×100%。

1.2.5 生化指標的檢測 常規培養的海馬神經元用含有10%胎牛血清的 DMEM稀釋成 5×105個/ml,每孔 1ml接種于24孔培養板中,使各孔細胞數基本相同;培養6 d,各組細胞按不同的要求處理,用于檢測生化指標。收集細胞上清液檢測MDA含量、SOD和 GSH-Px活力。細胞培養液直接加樣檢測。具體方法見試劑盒說明書。

1.2.6 檢測海馬神經元 Bcl-2 mRNA的表達 常規培養的海馬神經元用含有 10%胎牛血清的 DMEM稀釋成 1×106/ml,每孔 2 ml接種于 6孔培養板中,使各孔細胞數基本相同。培養6 d后各組按不同的要求處理,用于 RT-PCR檢測。β-action:引物序列為上 游 5′-gcaccacactttctacaatga-3′,下游 5′-gaaccgctcattgccgatagt-3′,508bp;Bcl-2:引物序列為上游 5′-cgactttgcagagatgtcca-3′,下游 5′-catccacagagcgatgttgt-3′,202 bp。 按照 常規步 驟提取各組細胞的 RNA,并逆轉錄成 cDNA。按設定的程序進行PCR擴增反應。反應條件:Bcl-2:94℃ 3 min,94℃ 40 s,48℃ 30 s,72℃ 45 s(循環 35次),72℃ 10min。 β-action為內參。瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR產物,用 Scion Image圖像分析軟件對電泳結果進行分析,以目的基因帶密度與內參 β-action帶密度的比值表示該基因 mRNA相對含量。

1.3 統計學處理 所有數據均以 x±s表示,用 SAS7.0統計軟件處理,進行方差分析和兩兩比較,對數據進行統計分析。

2 結 果

2.1 NYK藥物血清對 D-gal誘導損傷后海馬神經元存活率的影響 MTT法測定顯示,各組海馬神經元存活率均比正常對照組(細胞存活率設為 100%)低,模型組細胞存活率(0.367±0.104)顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比,VitE處理組(0.882±0.749)、5%NYK處理組(0.826±0.129)、10%NYK處理組(0.794±0.257)、20%NYK處理組(0.736±0.166)存活率升高(P＜0.01)。

2.2 NYK藥物血清對D-gal誘導損傷后海馬神經元 MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影響 模型組 MDA含量顯著高于正常對照組(P＜0.01)。5%、10%NYK處理組 MDA含量顯著低于模型組(P＜0.01)。模型組 SOD及 GSH-Px活力顯著低于正常對照組(P＜0.01)。VitE處理組和 NYK處理組 SOD及GSH-Px活力顯著高于模型組(P＜0.01)。見表 1。

2.3 NYK藥物血清對 D-gal誘導損傷后海馬神經元 Bcl-2 mRNA表達的影響 模型組(0.76±0.16)海馬神經元 Bcl-2 mRNA的表達水平與正常對照組(1.24±0.39)比較,有降低趨勢,但差異無統計學意義(P＞0.05)。VitE處理組、5%NYK處理組、20%NYK處理組海馬神經元 Bcl-2 mRNA表達分別為1.17±0.27、1.33±0.34、1.07±0.10。 10%NYK處理組海馬神經元 Bcl-2 mRNA的表達水平(1.48±0.62)高于模型組(P＜0.05)。見圖 1。

表1 各組海馬神經元的 MDA含量和SOD、GSH-Px活力的比較(x±s,n=6)

圖1 各組海馬神經元 Bcl-2mRNA的表達

3 討 論

腦和神經是耗氧率較高的器官,因為含有大量的脂質,容易因自由基引起氧化應激而變得脆弱。在對神經內科疾病進行分類時發現,以腦卒中、AD、肌萎縮性側索硬化癥及 Parkinson病等與氧化應激的關系最為密切〔8〕。AD患者腦組織和全身各系統都存在氧化應激,氧化應激是 AD發生發展過程中的關鍵因素,在 AD早期 NFT和 SP出現之前就發揮作用〔1〕,最終可造成神經元損傷。因此,近年來自由基所致的氧化應激反應在AD中的作用受到人們的高度重視,而且自由基損傷在散發性 AD的病因學意義更是AD研究中最活躍的領域之一。許多研究表明老年人和 AD患者腦內抗氧化物質減少,自由基增多。當體內 D-gal過多時,可產生過多的氧自由基,造成氧化應激損傷〔9〕。故本研究采用 D-gal誘導海馬神經元損傷,制備AD細胞模型,觀察NYK藥物血清通過抗氧化作用保護細胞,減少細胞凋亡的作用機制。

MTT可以間接反映活細胞的數量。GSH-Px是一種重要的催化H2O2分解的酶,SOD則主要清除超氧化物如。它們的活力降低,可造成腦內大量自由基的堆積,使許多生物大分子發生過氧化反應而交聯、斷裂,引起一系列異常的生化過程,以致細胞結構和功能破壞等。MDA是不飽和脂肪酸降解的產物,MDA的含量常可作為反映脂質過氧化程度及間接反映氧自由基對細胞損傷程度。此外Bc1-2基因家族中 Bcl-2是抑凋亡基因,同時也具有抗氧化劑作用,可以抑制超氧化物的產生;還可以誘導細胞內源性抗氧化物質表達,保護其活性,清除產生的自由基,起到抗凋亡作用〔10〕。本實驗提示 NYK有一定的神經保護作用,適宜的劑量(5%和 10%)對 D-gal致海馬神經元損傷的保護作用較好。其機制可能是通過提高神經元的抗氧化能力,降低海馬神經元的 MDA含量,減輕自由基損傷,上調海馬神經元 Bcl-2 mRNA的表達,從而發揮其細胞保護作用,減少細胞凋亡。

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2 耿勁松,周愛玲,茅家慧,等 .腦益康對 AD大鼠學習記憶及海馬NGF-TrkA mRNA表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2009;29(2):152-5.

3 朱 燕,周愛玲,茅家慧,等 .腦益康對 D-半乳糖和亞硝酸鈉所致Alzheimer病小鼠模型的保護作用〔J〕.中國應用生理學雜志,2008;24(3):296-300.

4 胡亞娥,周愛玲,朱 燕,等.腦益康藥物血清對谷氨酸誘導海馬神經元損傷的保護作用〔J〕.中國應用生理學雜志,2007;23(3):300-3.

5 王 睿 .中藥血清藥理學研究進展〔J〕.齊齊哈爾醫學院學報,2006;27(18):2243-4.

6 朱 燕,周愛玲,胡亞娥,等.腦益康含藥血清對 D-半乳糖誘導海馬神經細胞損傷的保護作用〔J〕.南通大學學報(醫學版),2006;26(1):3-5.

7 胡亞娥,周愛玲.中藥復方對原代培養海馬神經元生長影響的時效和量效關系研究〔J〕.南通醫學院學報,2004;24(4):363-4.

8 阿部康三.氧化應激與神經系統疾病〔J〕.日本醫學介紹,2006;27(12):556-8.

9 Wang J,Xiong S,Xie C,et al.Increased oxidative damage in nuclear and mitochondrial DNA in Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurochem,2005;93(4):953-62.

10 Ephrem E,Talin G,Rainer S,et al.Expression of apoptosis related proteins in brains of patients with Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett,2001;303(2):79-82.