內皮祖細胞捕獲支架防治犬肝靜脈再狹窄的實驗研究

王勇 張慶橋 祖茂衡 徐浩

肝靜脈狹窄或閉塞多見于肝移植術后和布加綜合征，肝移植術后肝靜脈狹窄的發生率達1%～4%[1]，布加綜合征血管成形術后再狹窄率高達10.3%[2,3]。目前，球囊擴張和/或支架置入是主要治療方法，但術后肝靜脈反復再狹窄仍是尚未解決的問題。本研究將CD34抗體通過底物涂布于支架上，依據抗原-抗體結合原理，期望支架“自動捕捉”血液中的EPCs，使之附著在支架表面上，分化成血管內皮細胞，促使支架表面迅速內皮化，以達到預防支架置入后再狹窄的目的。

1 材料與方法

1.1 材料 金屬裸支架（沈陽永通醫療器械有限公司），引導鋼絲，8F鞘管，壓力泵，低分子右旋糖苷（六安華源制藥有限公司），聚明膠肽注射液（武漢華龍生物制藥有限公司）,CD34 抗體（南京博湃生物技術有限公司），青霉素，熒光顯微鏡,阿司匹林，光學顯微鏡，掃描電子顯微鏡

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的準備 成年家狗24只，雌雄不限，每只體重22—25k g,由徐州醫學院動物實驗中心提供。將24只家狗按隨機數字法分為實驗組和對照組各12只，同時每組又分為2個亞組各6只，分別用于支架植入術后第1周和第8周取材檢測各項指標。

1.2.2 包被支架的底物選擇 取10mm×30mm大小的支架一枚，縱向剖開、展平、分割成6等分小片段，放入75 的乙醇中浸泡24h，隨機分成2組，聚明膠肽組和低分子右旋糖苷組。取聚明膠肽和低分子右旋糖苷各40m l，盛于無菌容器中，置于無菌操作臺上。將分好組的支架片段取出自然晾干，然后浸入各自底物中20s，取出后用電吹風吹干，如此反復5次。將包被好聚明膠肽和低分子右旋糖苷的支架片段分別浸入CD34抗體中，浸泡20s后取出，用電吹風吹干，如此反復5次。將包被好抗體的支架片段分別放置于熒光顯微鏡下進行觀察比較，根據熒光的強度、密度及分布來比較兩種底物的吸附效果，結果顯示聚明膠肽的抗體吸附效果比低分子右旋糖苷效果好。

1.2.3 CD34抗體包被支架體外吸附內皮祖細胞 利用密度梯度離心法分離培養家狗外周血內皮祖細胞，分別將包被好兩種底物及CD34抗體的支架浸泡在內皮祖細胞懸液中，培養12h，在掃描電子顯微鏡下觀察支架表面吸附的內皮祖細胞數量以及表面細胞分布密度。結果證實聚明膠肽作為支架底物效果優于低分子右旋糖苷，故選擇聚明膠肽作為最終底物包被支架。

表1 支架置入后第8周兩組血管內膜增生程度比較（ ）

1.2.4 支架的準備及分組 取10mm×30mm大小規格完全相同的12個支架,隨機分為實驗組和對照組，每組6個支架。2組支架浸泡于75%乙醇中24h，取出支架自然晾干后，再將2組的支架浸泡于聚明膠肽中，浸泡20s后取出，使用電吹風吹干，如此重復5次。將其中對照組包被好聚明膠肽的支架保存在無菌容器中，放置于4℃的冰箱中保存備用。將實驗組支架浸泡于CD34抗體中，20s后取出，使用電吹風吹干,反復5次，方法同前述。在熒光顯微鏡下觀察包被CD34抗體密度和分布情況。將包被有CD34抗體的支架保存在無菌容器中，放置于4℃的冰箱中保存。

1.2.5 肝靜脈支架置入術 將狗稱取體重后,肌肉注射(以下簡稱肌注)3 的戊巴比妥1m l/kg、阿托品5m g，仰臥位固定于血管造影床上。取右頸外側氣管旁，局部備皮，常規消毒鋪巾,采用外科手術方法分離暴露右頸靜脈，以18F穿刺針局部穿刺頸靜脈，插入導絲，引入4FCob ra導管,透視下將其尖端插入肝右靜脈,通過數字減影血管造影(DSA)了解肝靜脈走行，計算平均肝靜脈內徑。然后更換J形硬導絲，更換8F鞘管，將支架置入肝右靜脈主干。隨后再次造影證實支架通暢情況，測定支架兩端及中間部位支架腔內徑。實驗組與對照組支架置入方法相同，但實驗組置入CD34抗體包被支架，對照組則置入無抗體包被的支架。術畢結扎右頸靜脈，逐層縫合,常規消毒包扎。術后每只家犬肌注青霉素80萬U/d，連續3d；喂食阿司匹林100mg/d，術后一直服用。

1.2.6 肝靜脈造影復查 飼養至第8周的家狗處死前均要行肝靜脈DSA復查，以了解支架內有無狹窄及狹窄程度。造影方法同前，造影后測定每一支架兩端及中間部位支架內徑百分比，計算平均值及內徑百分比，并與支架置入后當時血管造影的結果進行比較。

1.2.7 標本采集及觀察指標 第一批動物與術后第1周行麻醉后，打開腹腔，沿下腔靜脈鈍性分離至肝靜脈入口，剝去周圍肝組織，剪開支架，取部分支架內組織（大小10mm×10mm）放入2.5 戊二醛固定液（0.1m o l/l，PBS配制）中保存，用于掃描電鏡觀察。第2批動物于術后第8周先行肝靜脈造影復查，后打開腹腔，沿下腔靜脈鈍性分離至肝靜脈入口，局部灌注肝素生理鹽水100m l以沖洗管腔內血液，連接壓力泵，再局部灌注10 的中性甲醛溶液20m l，確保血管取材至標本制作過程中不發生變形。取臨近支架肝靜脈血管組織和距離支架1cm處血管組織放入10 的中性甲醛溶液中固定保存，用于光學顯微鏡（以下簡稱光鏡）觀察。

1.2.8 掃描電鏡觀察 取出血管組織，用PBS反復沖洗3次，1 鋨酸固定2h，PBS反復沖洗3次，用30 、50 、70 、80 、90 、100 酒精逐級梯度脫水，每次15m in；100%的叔丁醇置換兩次，每次15m in，利用臨界點干燥器將組織塊脫水干燥，用真空噴涂儀于組織表面噴涂，最后置于掃描電鏡下觀察。

1.2.9 光鏡觀察 將預先保存固定的血管組織進行石蠟包埋和病理組織切片，每塊組織切片6張，H E染色。采用光鏡觀察組織病理形態學改變，并測定新生內膜厚度、新生內膜面積及狹窄百分面積。新生內膜面積為原始管腔面積與狹窄管腔面積之差值，狹窄百分面積＝（1－狹窄管腔面積 原始管腔面積）×100%。原始管腔面積為臨近正常血管管腔面積。

1.3 統計學方法 肝靜脈內徑、新生內膜厚度等數值變量組間比較采用t檢驗，平均支架狹窄百分比，平均狹窄百分面積的組間比較采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 聚明膠肽和低分子右旋糖苷包被支架的效果比較

2.1.1 抗體粘附效果比較

熒光顯微鏡下顯示聚明膠肽（圖1）的抗體粘附效果優于低分子右旋糖苷（圖2）。

2.1.2 兩種底物包被的CD34支架體外吸附內皮祖細胞情況比較

2種支架表面均有細胞吸附，聚明膠肽（圖3）的支架表面吸附的細胞數明顯多于低分子右旋糖苷（圖4）。

2.2 抗體支架預防支架內再狹窄的比較

2.2.1 血管造影結果比較：（1）兩組動物支架置入前肝靜脈平均內徑，實驗組為（7.0±0.61）m m，對照組為（7.1±0.56）m m，經t檢驗，兩組動物肝靜脈平均內徑統計學上差異無意義（t＝1.32，P＞0.05）。（2）肝靜脈造影復查：支架置入后第8周，行肝靜脈造影復查，其結果與支架置入后即刻造影結果比較，實驗組支架內腔基本通暢或支架壁輕度增厚（圖5），對照組支架壁明顯增厚（圖6）。支架狹窄百分比范偉6%-36%，中位數23%；對照組均顯示支架不同程度狹窄，狹窄百分比范圍43%-87%，中位數60%。經秩和檢驗，兩組比較差異有顯著性意義（t＝20，P＜0.01）。

2.2.2 掃描電鏡結果比較：術后第1周，實驗組（圖7）內皮細胞形狀較規則，排列方向一致，對照組（圖8）支架腔面內皮細胞稀疏，呈現不規則形，排列方向雜亂。

2.2.3 光鏡觀察結果比較：實驗組支架端血管內膜輕度增生（圖9），對照組支架端血管內膜增生顯著（圖10）。兩組支架內平均新生內膜厚度、平均新生內膜面積及平均狹窄百分面積測定比較，實驗組內膜增生程度明顯比對照組輕（表1）。

3 討論

血管內膜的完整性是維持血管正常功能和結構的重要條件，而內膜完整性的缺失則是新生內膜增厚的基礎。血管內膜損傷后血管平滑肌細胞活化,從收縮型轉向合成型，引發VSM Cs 的增生遷移和基質合成，導致管腔狹窄[4]。在人體外周循環中存在一定數量的EPCs，EPCs表面抗原有很多種，相對特異性的表達CD34抗原。本研究選擇特異性CD34抗體進行實驗，通過抗原-抗體結合反應選擇性的捕捉EPC s，使之附著在支架表面上，分化為血管內皮細胞，快速修復受損的血管內膜增殖分化為成熟的血管內皮細胞，使缺損的內皮得到快速修復，有效地減少新生內膜增生，從而達到預防支架內再狹窄的目的。

聚明膠肽能夠粘附CD34抗體，且具有良好的生物相容性，利于細胞的生長，以上生物學特性已得到證實[5]。本研究通過比較抗體包被支架表面抗體的熒光強度、密度、分布及支架體外吸附內皮祖細胞的效果，證明聚明膠肽的效果明顯優于低分子右旋糖苷，因此選用聚明膠肽作為最終的底物，進行支架包被。支架選用不銹鋼肝靜脈支架，已有國內學者做了不銹鋼支架表面抗體的固定及體外細胞相容性研究，本研究過程中也證實了此點。術后掃描電鏡觀察顯示，實驗組支架腔面內皮化程度明顯優于對照組；血管造影復查顯示，實驗組支架內腔開通情況明顯優于對照組，管腔狹窄百分比明顯低于對照組；光鏡檢查結果顯示，實驗組平均新生內膜厚度、平均新生內膜面積、平均百分狹窄面積均顯著低于對照組。以上資料表明，EPCs捕獲支架可以促進肝靜脈支架腔面的內皮生長，促使支架表面迅速內皮化，修復受損的血管內膜，達到預防肝靜脈支架置入后再狹窄的目的。

目前對EPCs捕獲支架的研究主要在冠狀動脈和頸動脈[6,7]，EPC s捕獲支架能夠有效預防動脈支架植入后再狹窄，尚未見到捕獲支架應用于肝靜脈的研究報道。國內進行了局部轉染V EGF基因金屬支架預防肝靜脈再狹窄的實驗研究[8]，但仍不能完全解決再狹窄的問題。基金支架制作工序復雜，EPC s捕獲支架制作相對簡便，且同樣能達到預防支架內再狹窄的目的。本研究的亮點在于首次將EPC s捕獲支架應用于預防肝靜脈支架置入后再狹窄，對于預防肝靜脈支架置入后再狹窄提供了新的理論依據，但還需進一步的臨床實踐檢驗。

[1]Kubo T, Shibata T, Itoh K, et al. Outcome of Percutaneous Transhepatic Venoplasty for Hepatic Venous Outflow Obstruction after Living Donor Liver Transplantation. Radiology,2006,239(1): 285-290.

[2]祖茂衡.深入開展布－加綜合征的基礎研究(述評)[J].介入放射學雜志,2006,15(9): 513-514.

[3]顧玉明,祖茂衡,徐浩,等.500例Budd-Chairi綜合征介入治療并發癥分析[J].中華放射學雜志,2003,37(12): 1083-1086.

[4]董偉華.血管成形術后再狹窄的機理[J].國外醫學臨床放射學分冊,1997,20: 26-9.

[5]袁晉青,高潤霖,史瑞文,等.豬冠狀動脈內金屬支架蛋白涂層的生物相容性研究[J].中國循環雜志,1998,13(5):271-273.

[6]Aoki J,Serruys PW, van Beusekom H,etal. Endothelial progenitor cell capture by stents coated with antibody against CD34: the HEALING-FIM(Healthy Endothelial Accelerated Lining Inhibits Neointimal Grow th-First In Man) Registry. J Am Coll Cardiol, 2005,45(10):1574-9.

[7]Walter DH, Cejna M, Diaz-Sandoval L, et al. Local gene transfer of phVEGF-2 plasmid by gene-eluting stents: an alternative strategy for inhibition of restenosis. Circulation, 2004,110:36-45.

[8]陳曉明,李子俊,梁偉民,等.局部轉染血管內皮生長因子基因預防肝靜脈支架再狹窄的實驗研究[J].中華放射學雜志,2003,37(1): 20-24.