終末糖基化產物、高脂誘導內皮細胞凋亡的作用途徑及葛根素的保護作用*

張 潔，郭茂娟，薛 亮，范英昌

細胞凋亡進程中重要的執(zhí)行者和與細胞凋亡進程密切相關的線粒體屬于細胞凋亡的信號轉導范疇。Caspase家族作為特異性的死亡信號傳導分子是凋亡的執(zhí)行者，Caspase-3作為凋亡級聯(lián)中的效應因子被稱為“殺手蛋白”。如果高糖高脂促進凋亡，則進一步信號轉導途徑的改變以明確凋亡的機制[1]。本實驗探討葛根素對血管內皮細胞的影響，研究葛根素在動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展中的多靶點調控作用[2-3]。首先通過終末糖基化產物（AGE）和氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）干預離體培養(yǎng)胎兒臍靜脈內皮細胞，從內皮細胞凋亡剝脫入手，離體探討糖尿病與斑塊糜爛的相關性，明晰斑塊糜爛的發(fā)病機制；其次選擇有效保護內皮細胞的中藥葛根素作為研究對象，觀察其穩(wěn)定斑塊的作用及相應機制，為合并高糖的動脈粥樣硬化患者防治提供實驗依據(jù)，開拓穩(wěn)定斑塊的新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 葛根素由協(xié)和醫(yī)科大學藥物研究所提供，AGES購自博奧森試劑公司，氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）購自北京中醫(yī)研究院，DMEM購自GIBCO公司，胎牛血清購自Hyclone公司，人臍靜脈內皮細胞株ECV－304購于天津血液病研究所。Caspase3試劑盒購自Santa Cruz公司，CD31單克隆抗體（1∶100 Sigma）購置天津市聯(lián)星生物制劑有限；流式細胞分析儀（BD），病理圖像分析系統(tǒng)。

1.2 細胞培養(yǎng) 采用人臍靜脈內皮細胞分離培養(yǎng)方法。無菌條件下取健康產婦臍帶,用Hanks緩沖液反復沖洗后,加入1%膠原酶，37℃消化15 min后終止，離心后加入完全培養(yǎng)液DMEM（5%小牛血清，1×105U/L青霉素，1×105U/L鏈霉素),置于 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后換液，待細胞80%融合，用胰蛋白酶－EDTA消化傳代，經CD31鑒定后，第2~3代用于實驗。

1.3 高糖高脂干預劑量及藥物濃度的確定

1.3.1 高糖濃度確定 用不同濃度（12.5，25，50，100，200 μg/mol）AGE 與內皮細胞共同孵育 24 h，噻唑藍（MTT）法測存活細胞數(shù)，繪制抑制率曲線，以確定最佳濃度，最終確定50 μg/mol為最佳濃度。

1.3.2 高脂濃度確定 用不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L)的ox-LDL與內皮細胞共同孵育24 h，MTT法測存活細胞數(shù)，繪制抑制率曲線，確定最佳濃度，最終確定50 mg/L為最佳濃度。

1.3.3 藥物濃度設定 根據(jù)前期的實驗結果，葛根素與內皮細胞孵育2 h后加入高糖高脂，共同孵育24 h。MTT法測存活細胞數(shù)，繪制抑制率曲線，確定最佳濃度，葛根素的最佳濃度是100 mg/L，洛伐他汀藥濃度為2 g/L，有效濃度為50 μmol/L。

1.4 實驗分組 1）正常組：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，不作任何處理。2）高糖加高脂（AGE+ox-LDL組）：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，并用高糖高脂進行干預。3）陽性對照藥組（AGE+ox-LDL組+洛伐他汀組）：在2）基礎上，用洛伐他汀干預。4）AGE+ox-LDL+葛根素組：在2）基礎上，用葛根素進行干預。

1.5 方法

1.5.1 采用相應的活性Caspase3抗體免疫細胞化學法檢測 生長良好的EVC304經消化后，接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜，待細胞長致八成滿。在處理因素作用48 h后，取出附有內皮細胞的蓋玻片，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍，0.4 g/L多聚甲醛固定，按SABC免疫酶標試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）方法進行。每張片子按照從上倒下，從左到有順序選取8個視野，計數(shù)Caspase3陽性細胞數(shù)，求得平均值作為該張片子的平均陽性細胞數(shù)。

1.5.2 流式細胞儀定量檢測凋亡細胞率 實驗用六孔培養(yǎng)板,1×106/孔,收集各組細胞加入羅丹明123染液 5 mg/L，37℃，5%二氧化碳（CO2）細胞培養(yǎng)箱孵育10 min，離心以培養(yǎng)基洗細胞兩次，重懸細胞于培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)60 min，流式細胞儀檢測：激發(fā)波長488～505nm，發(fā)射波長515～575 nm（一般為530nm）；MedFitLT3.0軟件分析細胞凋亡百分率。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。結果用均數(shù)±標準差（s）表示，經檢驗數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，則采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

圖1 內皮細胞FITC標記CD31×200

2 結果

2.1 CD31鑒定內皮細胞 見圖1。

培養(yǎng)的血管內皮細胞CD31FITC標記的免疫熒光，在熒光顯微鏡下觀察：胞漿染色顯示綠色，中間的核不著色，證實為內皮細胞。

2.2 免疫細胞化學法檢測Caspase3凋亡細胞數(shù) 葛根素處理人臍靜脈EVC304 48 h，Caspase3陽性細胞數(shù)與對照組明顯降低，內皮細胞中呈現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽性細胞。見表1。

2.3 流式細胞儀檢測各組凋亡百分比 與正常組相比,高糖高脂培36 h后明顯增加內皮細胞凋亡率,而葛根素預處理12 h后加入高糖作用36 h,凋亡率明顯下降。見表2。

表1 各組細胞Caspase3陽性細胞數(shù)（s）個

表1 各組細胞Caspase3陽性細胞數(shù)（s）個

注：與正常組比較，aP<0.01；與 AGES ＋OX－LDL 組比，bP＜0.05，AGES＋OX－LDL＋洛組與 AGES＋OX－LDL＋葛組相比，沒有統(tǒng)計學差異 P＞0.05。

組別正常組AGES+OX-LDL AGES+OX-LDL+洛AGES+OX-LDL+葛n8888 caspase3陽性細胞數(shù)3.375±1.59 22.375±9.22a 15.625±4.89b 15.375±4.47

表2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡百分率（s）%

表2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡百分率（s）%

注：與正常組比較，aP＜0.01；與 AGES ＋OX－LDL 組比，bP＜0.01，cP＜0.05，與 AGES＋OX－LDL＋洛組比。

組別正常組AGES+OX-LDL AGES+OX-LDL+洛AGES+OX-LDL+葛n8888凋亡率4.46±0.44 6.10±0.36a 2.40±0.12 1.10±0.55c

3 討論

血糖升高是糖尿病大血管并發(fā)癥的危險因素[4]，高糖可以導致多種形式的血管內皮細胞功能失調，其中內皮細胞凋亡被認為與糖尿病相關的動脈粥樣硬化加重有關[5]。本實驗證明在高糖環(huán)境下葛根素具有抗內皮細胞凋亡的作用，并減弱高糖誘導的凋亡相關蛋白Caspase-3活性。細胞凋亡是受細胞內源性基因、酶和信號傳導途徑調控的一個“瀑布式”激活過程。近年人們發(fā)現(xiàn)了一類在細胞凋亡的信息傳遞中具有重要作用的蛋白酶家族Caspase，目前已發(fā)現(xiàn)該家族中有16個成員，Caspase3則是這一家族的重要成員，它處于細胞凋亡過程中的關鍵地位[6]。Caspase3被激活后可裂解產生相對分子質量1.7萬的活性亞單位，后者可進一步激活Caspases活化的核酸內切酶（CAD），活化的CAD可切割DNA，導致細胞發(fā)生凋亡，在多種細胞的凋亡過程中均有Caspase3的活性的變化[7-8]。

實驗通過免疫組化的方法，檢測凋亡細胞數(shù)，結果顯示,在凋亡率最高的模型組中，Caspase3陽性細胞數(shù)最高，正常組Caspase3最低，說明Caspase3能夠直接反映細胞凋亡情況，跟凋亡密切相關。經過用藥干預，各治療組Caspase3陽性細胞數(shù)均明顯下降，細胞凋亡趨勢減弱，葛根素與陽性對照組Caspase3陽性細胞數(shù)比較，沒有統(tǒng)計學差異P>0.05。說明葛根素可通過抑制Caspase3的表達，減少內皮細胞的凋亡。

實驗采用流式細胞儀分析檢測凋亡百分比。結果發(fā)現(xiàn)：高糖高脂可以誘導人臍靜脈血管內皮細胞凋亡，而且進一步證明葛根素預處理后可以抑制高糖高脂誘導的內皮細胞凋亡,葛根素組和洛伐他汀作為陽性對照組內皮細胞凋亡均有明顯低于模型組（P<0.05），且葛根素組效果更好，說明葛根素能夠抑制高糖高脂環(huán)境下的內皮細胞凋亡。

最近研究表明葛根素由于其主要成分異黃酮具有雌激素樣作用，因此又被歸為植物雌激素。植物雌激素可以結合于雌激素受體發(fā)揮雌激素樣作用，可以預防某些癌癥的發(fā)生、抗氧化、清除氧自由基、降低血清膽固醇、促進細胞增殖。其對抗缺血缺氧、氧自由基過多性內皮細胞凋亡的作用，有利于維持血管內皮細胞的屏障功能和內分泌功能，可以減輕缺血后炎癥反應[3]，對預防臨床溶栓或血管介入治療中常出現(xiàn)的缺血/再灌注損傷具有積極意義。研究表明，葛根素對內皮細胞有保護作用，為臨床治療提供了理論依據(jù)。

[1]Durand E,Scoazec A,A Lafont J,et al.Thrombotic In Vivo Induction of Endothelial Apoptosis Leads to Vessel Thrombosis and Endothelial Denudation:A Clue to the Understanding of the Mechanisms of Thrombotic Plaque Erosion[J].Circulation，2004,109:2503-2506.

[2]范英昌,李 妍,趙福梅.葛根素對同型半胱氨酸損傷內皮細胞的影響[J].中國老年病學雜志,2006,26（3）:372-373.

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[4]盧雪玲,謝自敬,王 寧,等.2型糖尿病患者動脈粥樣硬化若干危險因素分析[J].中國動脈硬化雜志,2006,14(5):426-429.

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[8]宋 莉,宋 揚.IP6對人結腸癌細胞HT-29凋亡Caspase3 基因作用[J].青島大學醫(yī)學院學報,2008,44（3）：201-204.