山東半島地區貝類中諾如病毒污染狀況與病毒鑒定初報*

蘇來金,馬麗萍,徐仰麗,徐 靜,周德慶

諾如病毒(Noroviruses,NVs)是引發病毒性急性腸胃炎的主要病原體之一,該病毒在離體條件下存活力很強,主要通過被污染的食物、水等多種途徑進行傳播〔1〕。近年來,由于水環境污染的加劇,許多水產品遭到了NVs的污染,特別是濾食性雙殼貝類體內富集的NVs是周圍水環境中的幾十甚至上千倍〔2〕,致使世界許多地區均爆發了因生食含有NVs的雙殼貝類而引發的大規模腸胃炎疫情〔3-4〕,給人類健康造成了巨大威脅。因此,水產品中NVs的污染狀況調查是進行食品安全預警、防控食源性NVs疫情暴發的重要途徑。目前國內外對腹瀉病人糞便中諾如病毒分離株研究的報道較多〔5-7〕,證明在每一種NVs基因型中存在廣泛的多樣性,而對于雙殼貝類中NVs含量、種類、基因型別等研究較少〔8〕,國內貝類中NVs污染狀況和基因型別的調查研究尚未見報道。鑒于此,本研究對2007年9月至2008年8月在山東半島沿海8個地區采集的186份貝類樣品進行了RT-PCR檢測,并對NVs陽性分離株進行了鑒定分析,旨在了解山東半島地區貝類中NVs污染情況和毒株類型,補充我國水產品中NVs污染調查數據,為食源性NVs防治和分子流行病學調查積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2007年9月至2008年8月采集山東半島的萊州、招遠、煙臺、威海石島、乳山、青島等8個地區的長牡蠣(Ostrea crassostrea)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、櫛孔扇貝(Chlamys f arreri)、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)、縊蟶(Sinonovacula constricta)等貝類共186份樣品,取內臟置-80℃保存,作為待檢樣品備用。

1.1.2 主要試劑與儀器 配制溶液:蘇氨酸(Thr)緩沖液(0.1mol/L Thr,0.3mol/LNaCl,pH7.5);聚乙二醇(PEG)6000(24%PEG6000,0.6mol/L NaCl);PEG8000(16%PEG8000,0.525mol/L NaCl);PBS緩沖液(137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,10mmol/L Na2HPO4,2mmol/L KH2PO4,pH7.4);所有試劑配制用水均為焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過無 RNase的二次水。購置試劑:IPTG、X-gal、PGEM-T 載體、AMV 逆轉錄酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、RNase抑制劑等為均為Promega公司產品;One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit(TaKaRa);高純 RNA提取試劑盒(Roche);膠回收試劑盒(Omega);小量質粒提取試劑盒(TIANGEN)。主要儀器:3K15型高速冷凍離心機(Sigma,美國),SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠),BioPhotomete生物分光光度計(Eppendorf,德國)公司產品,PTC-200 PCR擴增儀(MJ,美國),LightCycler2.0熒光定量 PCR儀(Roche,瑞士),凝膠成像系統(Vilber Lourmat,法國)。

1.1.3 引物 根據文獻報道〔9-10〕本研究用于檢測NVs的引物及探針,見表1。

表1 用于NVs檢測的引物與探針Table 1 The primers and probes for detecting NVs

1.2 實驗方法

1.2.1 貝類樣品中病毒粒子的富集與RNA提取主要步驟:取25g貝類樣品,加入175mL蘇氨酸緩沖液勻漿3min,37℃孵育30min;4℃5 000×g離心20min,取上清;向沉淀中再次加入175mL蘇氨酸緩沖液重懸沉淀,4℃5 000×g離心20min;合并兩次上清液加入等體積 PEG6000溶液,冰上沉淀4h;4℃6700×g離心30min,棄上清;15mL PBS緩沖液重懸沉淀,加入等體積的氯仿,渦旋1min;4℃2000×g離心30min,取上清;上清液加入等體積PEG8000,冰上沉淀 2h;4℃14000×g離心 15min,棄上清;沉淀用200μL PBS緩沖液溶解,按照高純RNA提取試劑盒(Roche)說明書提取病毒RNA。

1.2.2 常規 RT-PCR檢測 RT反應體系為20μL,其 中包含 2μL 5 ×AMV Buffer,4μL 10 mmol/L dNTP Mix,1μL 的 20μ mol/L 通用引物,40U RNA酶抑制劑,5 U AMV反轉錄酶以及3μLRNA模板。反應條件為42℃,90min,反應結束后直接進行PCR反應。檢測GGI型NVs的PCR反應體系為 50μL,其中包含 5μL 10 ×Buffer,4μL的 2.5 mmol/L dNTP Mix,10 μ mol/L 引物 COGI-F、COG-I-R各1μL,2.5 U TaqDNA 聚合酶以及2μL cDNA。反應條件:94℃預變性3min;94℃變性30s,52℃退火 30s,72℃延伸30s,共 40個循環;72℃終延伸7min。檢測GGII型NVs的PCR反應體系為 50μL,其中包含 5μL 10 ×Buffer,4μL 2.5 mmol/L dNTP Mix,10 μ mol/L JV13I、JV12Y 各1μL,2.5 U TaqDNA 聚合酶以及 2μL cDNA。反應條件:94℃預變性3min;94℃變性60s,37℃退火90s,74℃延伸60s,共40個循環;74℃終延伸7min。擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠在1%TAE緩沖液中,100V電泳30min,EB染色,在凝膠成像系統下觀察拍照。

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測 熒光定量RTPCR反應體積為20μL,按照試劑盒說明書的體系配置反應液,上下游引物0.2μ mol/L,模板 RNA 1μL,混勻后加入 Roche專用石英毛細管中,在Roche定量 PCR儀中進行擴增。反應條件:42℃5min反轉錄;95℃5s,56℃30s共45個循環;40℃,10s冷卻結束反應。通過常規RT-PCR目的產物純化后體外轉錄的cRNA,經生物分光光度計測定濃度、計算拷貝數后梯度稀釋,作為熒光定量的標準品對病毒RNA進行相對定量。

1.2.4 克隆測序 陽性PCR產物用膠回收試劑盒純化后,插入載體pGEM18-T中,轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞,挑取重組子,搖菌后提取質粒,由上海博尚生物技術有限公司進行測序。

1.2.5 序列分析比較 測序獲得的序列應用BLAST軟件在GenBank尋找相近序列,利用DNAStar軟件進行序列的多重比對和分析;應用MEGA4.0軟件構建系統發生樹。用于系統發生分析的NVs參考株來自于GenBank數據庫,GGI-1～GGI-6參考株登陸號:M87661、L07418、U04469、AB042808、AF414406、AB081723;GGII-1 ～ GGII-3參考株為 U07611、AY134748、U22498;其中GGII-4 型參考株為:X866557、AF145896、AY587985、AY502023、Ab240190;GII-5～GII-8參考株:AF414423、AF397156、AF414409、AB039780;我國報道的參考株:EU794706、EU718209、DQ369797、EU703648。

2 結果與分析

2.1 NVs檢測結果 采集的186份樣品常規RTPCR檢測,用GI型引物檢測無目的片段檢出,用GII型引物檢測有5份擴增出目的片段,部分 RTPCR檢測結果見圖1,熒光定量 RT-PCR對GGII檢測陽性樣品RNA進行擴增,檢測情況及定量結果見表2。

圖1 部分貝類樣品NVs的檢測結果Fig.1 The NVs test result of some shellfish samples

表2 貝類樣品中NVs檢測情況Table 2 The result of NVs detection in shellfish samples

2.2 陽性株序列分析與遺傳進化樹 檢測出的5株NVs陽性毒株分別命名:Norovirus oyster/GII/QingDao,Norovirus clam/GII/WeiHai,Norovirus scallop/GII/RiZhao,Norovirus razorclam/GII/LaiZhou,Norovirus ark clam/GII/YanTai序列已上傳至GenBank中,登錄號見表2。PCR產物經克隆與測序,陽性株序列與參考毒株比較繪制遺傳進化樹(圖2)。

2.3 陽性毒株型別 陽性片段序列在GenBank中搜索比對,與近年來我國不同地區報道陽性株的同源 性 達 96%以 上(EU794706、EU718209、DQ369797、EU703648),與日本,英國 ,美國等地報道的GGII-4亞型遺傳距離較近(AB240190、X86557、AY502023),同源性90%以上,可以初步確定為從貝類中分離到的此5株NVs均屬于GII基因組型的GGII-4亞型。

3 討 論

根據NVs基因組的RdRp和衣殼蛋白核苷酸序列差異,可將NVs分為5個遺傳組(Genogroup),其中遺傳組I(Genogroup I,GGI)和遺傳組II(Genogroup II,GGII)以及暫定的遺傳組IV(Genogroup IV,GGIV)感染人類,遺傳組III(Genogroup III,GGIII)和遺傳組V(GenogroupV,GGV)分別感染牛和鼠,遺傳組GI和GII當前又分別區分為14和17個基因亞型〔11-13〕,重組NVs的出現使基因分型變得更為復雜,目前已經發現23株NV的RdRp和衣殼蛋白基因分屬于不同基因型〔14〕。這些基因型出現給NVs的檢測帶來了巨大困難。盡管NVs分類復雜,但在引起胃腸炎暴發的NVs中,GII-4型 NVs一直處于優勢地位〔15〕。自1992年以來,我國不同地區報道的NVs引發的嬰幼兒腹瀉研究中GGII-4型也是主要病原〔16〕。

圖2 NVs聚合酶區部分核苷酸序列遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic tree construct based on partial sequences of of NVs RNA polymerase region

NVs的流行地區廣泛,全年發病,但冬季較多見,Mounts〔17〕、Burkhardt 等 人〔18〕的研 究表明 ,NVs的感染主要集中在冬季。近年來,許多國家暴發的由于生食牡蠣等雙殼貝類而引發的NVs疫情也主要集中在秋冬季節〔19-21〕,本研究中檢出的5份陽性毒株,主要是冬季的貝類樣品。分析原因NVs可能同其他呼吸道病毒一樣,在冬季依靠干燥的空氣傳播,糞-口傳播是主要途徑,而病人腹瀉嘔吐物造成了食物和水的污染,牡蠣等貝類通過受污染的水域在體內富集了大量NVs,加上冬春季節也是牡蠣等貝類收獲季節,消費者生食牡蠣數量增加,因此冬季貝類中NVs檢出最高,因食牡蠣引發大規模NVs傳播的案例最多。

本研究從分子水平上初步揭示了山東半島地區貝類中NVs的污染狀況和基因型別,冬季為高發季節,由于樣品數量、采集地區的限制,尚不能全面的反映我國水產品中NVs的污染狀況,開展全國范圍水產品NVs污染狀況調查,對于了解水產品污染狀況,保障水產品國際貿易、疾病傳染預警等有著十分重要的現實意義。

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