廣州管圓線蟲ASP基因的克隆及原核表達*

郭鵬娟,詹希美,甘 明,李卓雅,于彥杰,潘智華,張美春,何 藹

廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis,Ac)是引起嗜酸性粒細胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎的重要病原體。幼蟲侵入人體,在體內移行,最終侵犯中樞神經系統,引起廣州管圓線蟲病〔1〕。該病主要發生在熱帶和亞熱帶地區,近年來,隨著人們飲食生活習慣的改變,該病病例呈逐年增多趨勢,越來越引起人們的重視。WHO公布的21世紀新出現的全球威脅性傳染病中就包括廣州管圓線蟲病;我國衛生部在2003年將其列為新發傳染病〔2-3〕。但目前關于該病的診斷、治療等研究仍較有限。天冬氨酸蛋白酶(Aspartic protease,ASP)是具有特征的一大類活性酶。研究證明,其在利什曼原蟲、盤尾絲蟲、血吸蟲及瘧原蟲等寄生蟲中,參與了重要的代謝過程,被認為是較好的診斷分子及疫苗候選靶位〔4-5〕。本試驗采用PCR技術選擇性的擴增ASP基因,并進行了體外原核表達,旨在為下一步利用重組蛋白研制廣州管圓線蟲病的診斷試劑盒及基因工程疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 血清 陽性病人血清為2006年夏季北京暴發期間臨床確診廣州管圓線蟲病病人血清。

1.1.2 菌株質粒文庫 廣州管圓線蟲幼蟲cDNA質粒文庫由本室構建。原核表達質粒pET-30a(+)及大腸桿菌BL21/DE3系本室保種。

1.1.3 主要試劑和工具酶 dNTP、ExTaq酶、T4DNA連接酶、SacⅠ、KpnⅠ酶及DNA分子量標準均購自TaKaRa公司。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自BBI;蛋白質分子量標準購自 Ferment公司。質粒小提試劑盒購于Qiagen公司。采用U-gene DNA凝膠回收試劑盒。Ni-IDA Agarose購自美國Novagen公司。抗組氨酸標簽單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗、DAB染色液均購自武漢博士德公司。

1.1.4 引物合成及質粒DNA測序 特異性引物合成及重組質粒DNA測序由大連寶生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 廣州管圓線蟲天冬氨酸蛋白酶基因的識別廣州管圓線蟲幼蟲cDNA質粒文庫(Library)系由本室與上海聯眾科技研究院合作構建,經文庫測序,對得到的大量Unigene基因進行分析及歸并。其中的編號為0008e10的序列含有完整的開放讀碼框,編碼產物為廣州管圓線蟲的天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease,ASP)。

1.2.2 ASP基因的擴增 根據已經獲得ASP基因的編碼序列,利用DNAClub及Primer5.0設計特異性引物。上游引物 P1:為引入的K pnⅠ酶切位點;

以上述cDNA為模板,進行PCR反應。反應條件為:94℃預變性5min,接著進行94℃變性45s,55℃退火30s,72℃延伸60s,反應30個循環,72℃延伸10min。所得PCR產物進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.3 重組表達質粒pET-30a-(+)-ASP的構建及鑒定 將目的基因及原核表達質粒pET-30a-(+)經KpnⅠ、SacⅠ雙酶切后回收,連接,轉化感受態大腸桿菌 BL21/DE3,經卡那霉素(Kana)篩選,陽性克隆進一步通過PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.2.4 pET-30a-(+)-ASP基因在大腸桿菌BL21中的誘導表達 挑取陽性單克隆菌落接種于5mL LB/kan(100μ g/L)液體培養基中,37℃,250 r/min振搖過夜培養12～16 h;將過夜培養物按照1∶100接種到LB/kan液體培養基中,37℃,250r/min培養2～3 h,至對數中期(OD=0.4-0.6);加入 IPTG至終濃度為1.0mmol/L,37℃,250 r/min振蕩培養6 h,取1mL表達產物,13 000 r/min離心 1min,收集菌體。沉淀中加入100μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液,重懸。沸水浴煮沸 3～5min,13 000 r/min離心1min,取上清10μL進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 時間和溫度對融合表達的影響 按照1.2.4方法,分別在誘導時間為2h,4h,6h,8h,10h留樣,SDS-PAGE電泳分析誘導時間對表達產物的影響;誘導溫度為25℃,30℃,37℃時,SDS-PAGE電泳分析溫度對表達產物量及可溶性的影響。

1.2.6 重組蛋白在大腸桿菌BL21中的大量誘導表達及親和層析純化 按照上述方法對陽性克隆進行大量誘導表達,離心收集菌體,按菌液:裂解緩沖液 (含 20mmol/L Tris-Cl、500mmol/L NaCl、5mmol/L咪唑,pH 7.9)=25∶1的比例加入裂解緩沖液,重懸菌體。加入溶菌酶至終濃度1mg/mL,混勻,冰上放置30min;冰上超聲法裂解細菌:功率150W,超聲 1s,停 2s,總時間 12min。4℃,6 000g離心30min,取上清,經 0.45μ m濾器過濾后,參照Ni-IDA Agarose說明書進行親和層析純化。洗脫的目的蛋白經 PBS(pH7.4)4℃過夜透析,SDSPAGE電泳分析后備用。

1.2.7 免疫印跡法檢測重組蛋白 以抗His標簽單克隆抗體(1∶1 000稀釋)及廣州管圓線蟲病人血清(1∶300稀釋)為一抗,山羊抗小鼠IgG-HRP溶液(1∶400稀釋)及羊抗人IgG-HRP為二抗,進行免疫印跡實驗,分析鑒定蛋白。

2 結 果

2.1 ASP基因的體外擴增 PCR特異性擴增目的基因,1.2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結果顯示在大約360bp的位置有一個明顯的擴增條帶,其大小與ASP基因編碼區長度一致,如圖1。

2.2 重組質粒的鑒定 重組質粒經過菌液PCR、質粒PCR及雙酶切鑒定,通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳得到清晰的酶切圖象,目的基因在360bp的位置,載體基因在5 422bp位置,如圖2。

2.3 重組蛋白原核表達純化的SDS-PAGE分析經鑒定含pET-ASP重組質粒的BL21菌株,不同溫度下,IPTG終濃度1.0 mmol/L,進行誘導表達。誘導產物經過親和層析純化,經15%SDS-PAGE鑒定,顯示在約16kD大小處有明顯的表達條帶(圖3),與理論分子量相符。蛋白純化效果較好。

2.4.1 重組蛋白的His-Tag鑒定 重組蛋白帶有6×his標簽,通過與His單克隆抗體反應,可以發現在相應的位置有條帶出現,如圖4。

2.4.2 重組蛋白的廣州管圓線蟲病人血清鑒定重組蛋白識別廣州管圓線蟲病人血清,可以在相應位置有反應條帶出現,如圖5。

3 討 論

天冬氨酸蛋白酶作為一種重要的活性酶,在脊椎動物中主要的天冬氨酸蛋白酶如,胃蛋白酶、組織蛋白酶D、E和腎素等都已經確認。這些酶參與降解和吞飲細胞內蛋白,尤其是組織蛋白酶大多都與蛋白降解有關,且組織分布廣泛。目前,天冬氨酸蛋白酶已經在很多線蟲中得到確認,包括秀麗隱桿線蟲、美洲板口線蟲、犬鉤口線蟲及糞類圓線蟲等〔6-9〕。由天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金屬蛋白酶組成的腸源性多酶體系已被認為是較好的線蟲疫苗候選抗原。有研究證明ASP在鉤蟲幼蟲侵入宿主過程中有重要作用,楊玉榮等對犬鉤蟲的ASP基因進行了體外克隆,進行了初步的研究,并推測認為其在引起宿主的免疫反應方面有重要作用,是抗鉤蟲疫苗的可能的候選分子〔10〕。在數種寄生蟲病中,天冬氨酸蛋白酶已經是一些臨床用藥的靶位。

廣州管圓線蟲天冬氨酸蛋白酶的功能未知。本課題利用基因克隆和重組表達的方法將廣州管圓線蟲ASP基因進行體外表達,獲得純化的重組蛋白。免疫印跡(Western blotting)顯示該目的蛋白能被廣州管圓線蟲病人血清所識別。為進一步研究該蛋白在廣州管圓線蟲中的作用奠定了基礎。

圖5 融合蛋白與廣州管圓線蟲病人血清的免疫印跡反應Fig.5 Western blotting analysis of fusion protein with patients serum.

〔1〕詹希美.人體寄生蟲學(八年制)〔M〕.北京:人民衛生出版社,2005,227-229.

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