耐環丙沙星大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性探討*

張馨琢,黃永茂,陳 莊,鐘 利,陳 楓,游春芳,鄧 敏

國內各地近年來報道大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)對環丙沙星(ciprofloxacin,CIP)的耐藥率已超過50%,并且這些耐CIP菌株對氨基糖苷類藥物(aminoglycosides,AGs)的耐藥形勢逐漸嚴峻,其耐藥機制最重要的是產生氨基糖苷類修飾酶,此類酶作用于藥物特定的氨基或羥基,使藥物鈍化,使其降低或喪失對靶位核糖體的親和力,使細菌在藥物存在的情況下仍能存活。為此本文對臨床分離的耐CIP大腸埃希菌對AGs藥物的耐藥表型和基因型進行了相關分析,為臨床合理選用AGs藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 分離自本院 2007年 7月至2008年7月非腸道感染的住院病例大腸埃希菌75株(不含同一病人同一部位感染的重復菌株),經MicroScan WalkAway-40型全自動細菌鑒定儀鑒定。大腸埃希菌質控株ATCC 25922購自國家臨床檢驗中心。

1.1.2 主要試劑 環丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星紙片均購自杭州天和微生物試劑公司;M-H培養基、胰大豆蛋白胨肉湯購自英國Oxiod公司;LB液體培養基購自上海生工生物技術公司;Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司;2×Taq PCR MasterMix試劑盒、電泳瓊脂糖購自北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗 按NCCLS推薦的紙片擴散法(Kerby-Bauer法)測定75株大腸埃希菌對環丙沙星(CIP)的耐藥率,把菌株分為耐CIP組與非耐CIP組。K-B法測定2組菌株對6種AGs(鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星)的耐藥性。以大腸埃希菌ATCC 25922為質控菌株。結果判讀參照NCCLS2006常規標準。

1.2.2 氨基糖苷類修飾酶(AMEs)基因檢測 用Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒提取大腸埃希菌臨床分離株和標準菌株ATCC 25922的基因組DNA,操作步驟按照說明書進行。參考文獻〔1〕設計6對引物,由上海生工生物技術公司合成,見表1。PCR反應采用2×Taq PCR MasterMix試劑盒,按說明書進行操作。6種靶基因PCR擴增體系均為:每反應體系加入 P1、P2引物各 10μ mol/L,dNTP each 6.25μ mol/L,KCl 1 250μ mol/L,MgC12 37.5μ mol/L,Tris-HCl(pH8.3)250μ mol/L,Taq Polymerase 1.25U,總反應體積 25μL,其中模板液5μL。PCR反應循環參數為:94℃預變性 3min,94℃變性30 s,55℃退火 30s,72℃延伸30s,共 30個循環;循環結束后72℃延伸5min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳80V 50min,以DNA 100-600bp ladder Marker為分子量標記,電泳后用全自動凝膠成像系統觀察PCR產物的大小并貯存結果。收集到DNA溶液(未純化)用核酸定量儀測得濃度＞390ng/μL,送至上海生工生物技術公司進行基因測序。

表1 6種氨基糖苷類修飾酶基因引物序列Table 1 The primers'sequeses of six aminoglycosides modifing enzymes genes

1.2.3 統計學方法 采用SPSS14.0進行χ2檢驗,比較耐CIP組與非耐CIP組之間對氨基糖苷類的耐藥表型和基因型有無差別。α=0.05。

2 結 果

2.1 藥物敏感試驗結果 75株大腸埃希菌中,53株(70.67%)對CIP耐藥。耐CIP組對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素的耐藥率較高:73.58%、64.15%、62.26%,對慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素的耐藥率與非耐CIP組的差異有統計學意義(P＜0.05),耐CIP組與非耐CIP組對6種AGs耐藥率的比較詳見表2。耐CIP組以多重耐藥表型常見,且比例明顯高于非耐CIP組(P=0.001),而非耐CIP組全敏感表型所占比例與耐CIP組的差異有統計學意義(P=0.002),耐CIP組與非耐CIP組對6種AGs耐藥表型的比較詳見表3。耐CIP組對AGs的多重耐藥表型復雜:16株(30.19%)對3種AGs耐藥,7株(13.21%)對5種AGs耐藥;而非耐CIP組僅3株表現為多重耐藥。

2.2 氨基糖苷類修飾酶基因檢測結果 耐CIP組AMEs基因的總檢出率為 77.36%,其中 30株(56.60%)檢出aac(3)-II,22株(41.51%)檢出 aac(6′)-I。22株非耐 CIP菌株 AMEs基因的總檢出率為59.09%,其中 aac(3)-II、ant(3〞)-I的檢出率較高。aac(6′)-I的檢出率,耐CIP組明顯高于非耐CIP組(P=0.006);其余5種基因檢出率的差異無統計學意義(P＞0.05)。耐CIP組與非耐CIP組AMEs基因檢出率的比較詳見表4、圖1。單基因型、雙基因型、三基因型的檢出率在耐CIP組與非耐CIP組中的差異無統計學意義(P＞0.05),見表5。耐CIP組中,對應6種AGs的耐藥表型,aac(3)-II在全敏、單耐藥、雙耐藥、多重耐藥中的檢出率分別為:33.33%、50%、45.45%、62.50%;aac(6′)-I在對AGs的全敏、單耐藥、雙耐藥、多重耐藥表型中的檢出率分別為:0、0、27.27%、59.38%;ant(2〞)-I在對AGs的(全敏+單耐藥+雙耐藥)表型中的檢出率為9.09%,在多重耐藥表型中的檢出率為9.38%;ant(3〞)-I在對AGs的(全敏+單耐藥+雙耐藥)表型中的檢出率為9.09%,在多重耐藥表型中的檢出率為21.88%。由此可見,隨著耐CIP菌株對AGs耐藥種類的增加,AMEs基因的檢出率也逐漸增高,以aac(3)-II、aac(6′)-I最為明顯,并且對AGs多重耐藥的菌株常常檢出多個AMEs基因;而非耐CIP菌株耐藥表型與基因型的關系未呈現此現象。各組PCR產物經基因測序后證實是E.coli的 aac(3)-II、aac(6′)-I、ant(3 〞)-I、ant(2〞)-I、aac(3)-I基因序列。

表2 耐CIP與非耐CIP菌株AGs耐藥率的比較Table 2 Drug resistant differences between ciprofloxacin-resistant strains and non-ciprofloxacin-resistant strains to aminoglycoside antibiotics

表3 耐 CIP與非耐CIP菌株AGs表型的比較Table 3 Difference of drug-resistant phenotypes between ciprofloxacin-resistant strains and non-ciprofloxacin-resistant strains to aminoglycoside antibiotics

表4 耐CIP與非耐CIP菌株AMEs基因型的比較Table 4 Difference of AMEs genetypesbetween ciprofloxacin-resistant strains and non-ciprofloxacin-resistant strains

表5 耐CIP與非耐CIP菌株 AMEs基因型比較Table 5 Difference of AMEs genetypesbetween ciprofloxacin-resistant strains and non-ciprofloxacin-resistant strains

圖1 PCR電泳圖譜Fig.1 Electrophoregram of PCR

3 討 論

大腸埃希菌是臨床上細菌感染常見病原菌之一。隨著抗菌藥物的廣泛應用,細菌的耐藥性日趨嚴重,給臨床抗感染治療的抗生素選擇增加了難度。本地區耐CIP的臨床分離株對慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素的耐藥率比非耐CIP菌株有明顯增高(P＜0.05),且對AGs的耐藥表型復雜,其中多重耐藥表型占56.60%,明顯高于非耐CIP菌株(P＜0.05);而非耐CIP菌株則以全敏感、單耐藥表型較為多見。耐CIP菌株對大部分AGs的耐藥率增高,且容易發生對AGs的多重耐藥,這可能與耐CIP菌株同時攜帶多種耐藥基因有關〔2-5〕。

耐CIP菌株對慶大霉素(73.58%)、卡那霉素(64.15%)、鏈霉素(62.26%)的耐藥率較高,并且對AGs藥物出現了較高的交叉耐藥率。其耐藥機制復雜,其中最重要的機制是產AMEs。目前從美國GenBank核酸庫已能檢索到AMEs 30多種基因型,但在大腸埃希菌中以 aac(3)-II、aac(6′)-I、ant(3〞)-I等基因型為常見。本文AMEs基因檢測結果具有相似的結果:耐CIP菌株AMEs基因的總檢出率為 77.36%,其中 aac(3)-II為 56.60%,aac(6′)-I為 43.40%,耐 CIP 菌株 aac(6′)-I的檢出率明顯高于非耐CIP菌株(P=0.006)。本文發現一株耐CIP菌株(標本號20060)的基因擴增序列與GenBank gb|DQ303918.1|大腸埃希菌氟喹諾酮乙酰化氨基糖苷乙酰轉移酶基因aac(6')-Ib-cr的核苷酸序列相匹配,與文獻報道相似〔6〕。aac(6')-Ib-cr是aac(6')-Ib-cr的一種變異體,兩處堿基的突變賦予了其修飾喹諾酮類的特性。AAC(6')-Ib-cr不僅可以修飾氨基糖苷類藥物,對環丙沙星、諾氟沙星等喹諾酮類藥物也具有乙酰化修飾作用〔7-9〕。

耐CIP菌株多表現為多基因型和多重耐藥表型,且兩者關系較為復雜,耐藥表型和AMEs基因檢測結果未能達到一一對應;而非耐CIP菌株則以單基因型和單耐藥表型多見。AMEs在細菌體內的實際表達量以及細菌對藥物的攝入和水解速度都可能影響分離菌最終的耐藥表型〔10〕。

綜上所述,本地區耐CIP大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物的交叉耐藥情況較為常見,耐CIP菌株多表現為同時對多種氨基糖苷類藥物耐藥。耐CIP大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物的耐藥與氨基糖苷類修飾酶存在一定相關性,以AAC(6′)-I最為明顯。

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