p21和p27基因多態性與女性肺癌的關聯研究

李作生 李保慶 王國臣

p21和p27基因是調控細胞周期的相關基因。在細胞周期的G1/S期的調控中，通過與cyclin－cdk復合物結合抑制Rb蛋白磷酸化，從而誘導細胞周期阻滯，因而被認為是抑癌基因。p21基因外顯子 3的 3’非翻譯區(3’untranslated region，3’UTR)第20堿基對存在單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，核苷酸出現 C→T 突變(3’UTR 多態性)，p27基因第109密碼子存在V109G多態性，核苷酸出現T→G突變。研究表明p21和p27基因多態性與口腔鱗癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的發病風險有關［1－3］。本研究檢測了華北煤炭醫學院附屬醫院胸外科和河北醫科大學第四醫院2003年1月至2006年1月女性人群中非小細胞肺癌(non－small cell lung carcinoma，NSCLC)遺傳易感性及淋巴結轉移與p21和p27基因單核苷酸多態性SNPs的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例組選取110例NSCLC病例，經手術或支氣管鏡檢查證實。年齡27～76歲，平均年齡57.1歲。對照組124例，年齡29～70歲，平均年齡54.9歲，無腫瘤及遺傳病史。

1.2 外周血白細胞DNA提取 研究對象均抽取外周靜脈血5 ml，經枸櫞酸鈉抗凝，于4℃冰箱保存，并于采血后1周內提取外周血白細胞DNA。DNA提取采用蛋白酶K消化－飽和氯化鈉鹽析法。

1.3 p21、p27 SNPs基因分型 p21、p27基因型檢測應用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性分析(polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP)方法進行。p21 SNP 擴增引物為 5’－GAATTTGCCGTTGGGTCAAG－3’(上游引物)和 5’－AGGAGAACACGGGATGAGGAG－3’(下游引物)［3］。p27 SNP 擴增引物為5’－TGCAGACCCGGGAGAAAG－3’(上游引物)和 5’－CCGCTAACCCCGTCTGG－3’(下游引物)［3］。PCR反應體系均為25 μl，其中模板 DNA 100 ng，10× PCR緩沖液 2.5 μl，Taq－DNA 聚合酶2.5 U，MgCl22.0mm ol/L，dNTPs 0.2mmol/L，上、下游引物各0.2 μmol/L。PCR反應條件為:94℃預變性 10 min，94℃ 45 s，58℃ 45 s(p21)或 60℃ 45 s(p27)，72℃ 60 s，35 個循環后，72℃ 延伸 7 min。取 8 μl PCR產物進行限制性內切酶消化，經3%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。p21基因的PCR產物經限制性內切酶PstⅠ37℃酶切后，C/C基因型產物為133、256和479 bp 3個DNA片段，T/T基因型表現為133 bp和735 bp 2個片段，C/T雜合型表現為133、256、479、735 bp 4個片段(圖1)。p27基因的PCR產物經限制性內切酶BglⅠ37℃酶切后，T/T基因型表現為76 bp和378 bp 2 個片段，G/G 型為76、113、265 bp 3 個片段，T/G 型為76、113、265、378 bp 4個片段(圖2)。以蒸餾水替代模板DNA作為陰性對照。隨機抽取10%的DNA標本進行重復實驗。

1.4 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，比較基因型頻率的觀察值與預期值應用χ2檢驗進行Hardy－Weinberg平衡檢驗。2組的基因型分布、等位基因型頻率的比較均采用四格表χ2檢驗。以非條件Logistic回歸法計算表示相對風險度的比值比(odds ratio，OR)及其 95%可信區間(confidence interval，CI)，并經年齡校正，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般特征 2組的年齡構成比、吸煙狀況間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 p21基因SNPs分布 所有DNA標本均經PCR－RFLP方法成功進行了基因分型，所有重復分型結果均與原結果相符。

2.2.1 p21基因型分布在2組均符合 Hardy－Weinberg平衡。p21基因C和T等位基因在2組的分布間差異有統計學意義(P＜0.01)，p21基因突變型(C/T+T/T)頻率在病例組(76.4%)顯著高于對照組(56.5%)(χ2=10.27，P ＜0.01)。攜帶T等位基因(C/T和T/T基因型)能顯著增加這一人群NSCLC發病風險［經年齡校正的 OR=2.60，95%CI(1.46，4.61)］。見表1、2。

2.2.2 根據個體吸煙狀況的分層分析表明，在不吸煙個體中，p21基因突變型頻率在病例組(86.0%)顯著高于對照組(56.4%)(χ2=19.02，P ＜0.01)。與C/C基因型相比，C/T和T/T基因型可顯著增高不吸煙女性的NSCLC發病風險［經年齡校正的 OR=4.95，95%CI(2.36，10.40)］。見表 2。

2.2.3 在對年齡進行的分層分析顯示，在≥50歲年齡組，p21基因突變型頻率在病例組(76.6%)明顯高于健康對照組(56.7%)(χ2=8.48，P ＜0.01)。攜帶 C/T、T/T基因型較 C/C基因型能顯著增加50歲以上女性人群NSCLC發病風險［經年齡校正的 OR=2.68，95%CI(1.41，5.08)］。見表 2。

2.3 p27基因SNP分布 p27基因型分布在2組均符合Hardy－Weinberg平衡。p27等位基因頻率和基因型總體分布在病例組和對照組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。攜帶G等位基因不增加這一人群NSCLC發病風險。根據吸煙狀況和年齡進行的分層分析也未發現這一多態性與NSCLC發病風險有關。見表 1、3。

2.4 p21、p27基因SNPs與NSCLC淋巴結轉移的關系 對有淋巴結轉移的73例NSCLC患者進行了分層分析。結果顯示，p21和p27基因多態性與NSCLC患者的淋巴結轉移無關。

圖1 PCR－PstⅠ酶切的p21SNP基因分型

圖2 PCR－BglⅠ酶切的p27SNP基因分型

3 討論

p21基因定位于人第6號染色體短臂的2帶1區(6p21.2)為單拷貝基因［4］。p21有幾種多態性，報道較多的是以下兩種多態性:一是在外顯子2第31密碼子(p21c31多態性)，核苷酸出現C→A改變，導致氨基酸出現絲氨酸－精氨酸(ser－arg)改變，并且有研究認為A等位基因的出現使p21轉錄明顯下降從而使其蛋白表達減低［5］;另一種是3’UTR多態性。每一種多態性都被認為能夠改變p21的功能［6］。p21多態性中的高風險基因型被認為與包括口腔鱗癌、乳腺癌及前列腺癌在內的多種惡性腫瘤有關［1－3］。本研究結果與以上研究結果一致，表明攜帶C/T、T/T基因型較之C/C型能顯著增加這一人群NSCLC發病風險。

表1 2組一般情況及等位基因型頻率 例(%)

表2 p21基因多態性分層分析 例(%)

表3 p27基因多態性分層分析 例(%)

表4 p21和p27基因型與淋巴結轉移的關系 例(%)

吸煙是公認的肺癌發病危險因素，且有研究認為某些基因多態性在肺癌發病風險方面與吸煙有協同作用［7］，但本研究顯示，p21突變型只增加不吸煙女性NSCLC發病風險，并未發現吸煙與攜帶T等位基因對增加NSCLC發病風險有相互作用。因此，對p21 SNP僅影響不吸煙者肺癌發病風險的確切機理還有待進一步探討。

本研究以年齡50歲為界進行了分層分析，結果顯示在≥50歲年齡組中，p21基因突變型能顯著增加50以上人群NSCLC發病風險。這一結果也提示在NSCLC的發病中，在遺傳易感性的基礎上，外界環境因素持續或間斷作用于機體，經過數年引起的代謝改變，最終導致NSCLC的發生。

p27基因定位于人第12號染色體短臂1區2帶和1區3帶第一亞帶之間(12p12－12p13.1)［8］。目前報道的p27 SNP位于第109密碼子，核苷酸出現T→G突變(GTC→GGC)，導致氨基酸出現纈氨酸(Val)→甘氨酸(Gly)替代，即V109G多態性。在本研究中，沒有顯示出p27突變基因型與NSCLC易感性有關，經吸煙狀況、年齡進行的分層分析也均未顯示出有統計學意義。而Kibel等［3］的研究則認為VV基因型(T/T基因型)是危險基因型，該基因型增加了晚期前列腺癌的發病風險。Thomas等［1］的研究則認為攜帶突變型(T/G、G/G)的早期乳腺癌患者預后差。Li等［2］也認為在口腔鱗癌中，突變的G/G型是危險因素。上述研究結果說明對于p27V109G多態性的研究結果存在較大分歧。另外，p27基因在腫瘤細胞中很少有突變和甲基化，且其功能的改變是轉錄后調節，因此對于其基因多態性與腫瘤易感性的相關性研究的價值可能會降低［8，9］。

腫瘤是否發生侵襲和轉移是決定個體治療方案和預測患者預后的關鍵指標。雖然有研究顯示p21低表達使腫瘤淋巴結轉移增加［9］，攜帶p27V109G突變型能增加乳腺癌患者淋巴結轉移數目［1］，但我們的研究結果顯示，p21和p27基因多態性不增加NSCLC患者淋巴結轉移風險。

1 Thomas S，Lewin E，Uwe－Jochen G，et al.The V109G polymorphism of the p27 gene CDKN1B indicates a worse outcome in node－negative breast cancer patients.Tumor Biology，2004，25:306－312.

2 Li G，Sturgis EM，Wang LE，et al.Association between the V109G polymorphism of the p27 gene and the risk and progression of oral squamous cell carcinoma.Clin Cancer Res，2004，10:3996－4002.

3 Kibel AS，Suarez BK，Belani J，et al.CDKN1A and CDKN1B Polymorphisms and Risk of Advanced Prostate Carcinoma.Cancer Res，2003，63:2033－2036.

4 Smith CAD，Smith G，Wolf CR.Genetic polymorphisms in xenobiotic metabolism.Eur J Cancer 1994，30:1921－1935.

5 Su L，Sai Y，Fan R，et al.P53(codon 72)and P21(codon 31)polymor－phisms alter in vivo mRNA expression of p21.Lung Cancer，2003，40:259－266.

6 Mousses S，Ozcelik H，Lee PD，et al.Two variants of the CIP1/WAF1 gene occur together and are associated with human cancer.Hum Mol Genet，1995，4:1089－1092.

7 Yu CY，Pan KF，Xing DY，et al.Correlation between a single nucleotide polymorphism in the matrix metalloproteinase－2 promoter and risk of lung cancer.Cancer Res，2002，62:6430－6433.

8 Ponce－Castaneda V，Lee MH，Latres E，et al.p27kip1:chromosomal mapping to 12p12－12p13.1 and absence of mutations in human tumors.Cancer Res，1995，55:1211－1214.

9 管曉翔，陳龍邦.腫瘤細胞蛋白錯位分布和低表達的分子機制.中華腫瘤防治雜志，2006，13:786－789.