MMP－9、OPG在風濕鈣化二尖瓣的表達及意義

白傳明 張彬 張志剛 宋書田 周岊梧

目前，我國風濕性心臟瓣膜病在心臟疾病中仍占有很高的比例。風濕性心臟瓣膜病變的主要病理改變為瓣葉的增厚、攣縮、纖維化及不同程度的鈣化，從而導致瓣口面積減小和關閉不全。雖然前人對此已經做了大量研究，然而其病理形態的發生機制尚不清楚。基質金屬蛋白酶－9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)是一種鋅離子依賴性明膠酶，可降解細胞外基質成分，在骨骼發育及骨關節炎的研究中發現其可降解膠原和蛋白聚糖，引起細胞外基質重塑，同樣這一發現在退行性主動脈瓣鈣化的研究中得到了證實，但對于風濕性二尖瓣的研究尚未有過。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)做為一種可溶性腫瘤壞死因子(TNF)受體，在骨代謝方面的研究日益受到人們的重視。本研究旨在觀察MMP－9、OPG在風濕鈣化二尖瓣的表達。

1 資料與方法

1.1 一般資料 來自2007年6月至2008年10月我院行二尖瓣置換手術所切除之瓣膜，共42枚，依病史分為風濕鈣化組(24枚)和非風濕鈣化組(18枚)。

1.2 方法 將手術切取下的二尖瓣取25mm2瓣葉組織制成蠟塊，切片SP法免疫組織化學染色觀察MMP－9和OPG的表達。

1.3 評定標準 細胞漿中出現棕黃色顆粒即為陽性細胞。參考Mohsin等［1］報道的標準進行改良，采用陽性細胞比例和著色強度兩項綜合評定陽性結果，故采用計分法，即陽性細胞數＜25%計0分、25%～50%計1分、51%～75%計2分、＞75%計3分;輕度著色計1分、中度著色計2分、重度著色計3分。每張切片的兩項得分之和為該病理陽性結果。＜3分的為陰性、≥3分的陽性。

1.4 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

風濕鈣化組MMP－9和OPG的陽性表達率與非風心病組比較差異有統計學意義(χ2值分別為21.034和21.073，P＜0.01)。見表1，圖1～4。

表1 2組MMP－9和OPG陽性結果比較 例(%)

圖1 MMP－9陰性切片(SP×200)

圖2 MMP－9陽性切片(SP×200)

圖3 OPG陰性切片(SP×200)

圖4 OPG陽性切片(SP×200)

3 討論

風濕熱侵犯心臟瓣膜，引起瓣膜增厚、變硬、卷曲、縮短和鈣化，引起瓣口面積狹小和關閉不全，從而引起嚴重的血流動力學改變，但引起瓣膜鈣化的機制尚不清楚。MMP－9和OPG在近年來骨代謝研究領域日益受到人們的關注，然而其在風濕鈣化瓣膜方面的研究筆者尚未見報道。

MMP－9是一種鋅依賴性肽鏈內切酶，屬于Ⅳ型膠原酶，又稱明膠酶B，在體內可由多種細胞合成，以無活性的酶原形式分泌，經血漿酶切斷其N2端被激活，主要參與細胞外基質的降解與重塑。其作為降解血管基底膜的主要成分Ⅳ型膠原的主要酶類，和動脈粥樣硬化的發生發展密切相關。近年來研究表明MMP－9與動脈粥樣硬化斑塊鈣化并加重主動脈狹窄有關［2］。Kaden等［3］報道MMP在正常主動脈瓣中以酶原的形式存在，在鈣化瓣膜中被激活。在本研究中發現風濕鈣化的瓣膜組織中MMP－9明顯高于對照組(P ＜0.01)，考慮與MMP－9降解細胞外基質和基底膜成分，引起瓣膜增厚，導致鈣鹽沉積有密切關系。Fondard等［4］研究發現MMP－9在主動脈瓣狹窄的瓣膜組織中表達明顯增高，并且認為MMP－9并非為瓣膜間質細胞所分泌，而是主要來源于巨噬細胞。風濕熱引起心臟瓣膜的炎性反應，可使瓣膜內皮不同程度受損，基底膜和膠原纖維暴露出來，膠原纖維增生致密，并引起受損部位的內皮細胞及黏附的淋巴細胞、血小板等合成并釋放多種細胞因子，如生長因子、趨化因子，這些因子可作用于內皮細胞、單核－巨噬細胞，誘導其表達MMP－9增多。過度表達的MMP－9大量降解瓣膜的細胞外膠原和蛋白聚糖，引起細胞外基質代謝紊亂，導致瓣膜結構重塑，彈性下降，僵硬度增加。同時MMP－9在瓣膜內皮下聚積可進一步加重其損害，內皮層的破損使鈣濾過增加并沉積到組織深層，繼而基底膜和膠原纖維暴露出來，膠原纖維增生，鈣鹽通過破損的內皮沉積到組織深層使得瓣膜增厚鈣化。

OPG是含4～5個潛在糖化位點的分泌型糖蛋白，為TNF受體超家族成員，又稱破骨細胞形成抑制因子。OPG mRNA廣泛表達于多種組織和細胞系，成年人心、肺、腎和骨組織合成OPG較多，胎盤、肝臟、甲狀腺、脊髓、腦、脾、前列腺和胃腸道等也可合成。體外培養條件下高表達OPG的細胞系有成骨細胞譜系、內皮細胞、成纖維細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞和多種腫瘤細胞株等。OPG的生物學效應主要表現為抑制破骨細胞的分化和成熟，從而抑制骨吸收。對轉基因小鼠研究表明，過表達OPG的小鼠出現嚴重的骨硬化，伴骨髓腔縮小而致代償性骨髓外造血，全身小梁骨礦化增加，破骨細胞數目明顯減少。Hofbauer等［5］進一步研究發現，過表達OPG的小鼠表現為早期、進行性大理石樣骨病，病變累及長骨、脊椎骨和骨盆等多個部位。因此我們推測風心病導致的瓣膜鈣化可能與OPG的表達有關。本研究發現，在風濕鈣化組的瓣膜表達OPG增多。Deckers等［6］研究發現血管內皮生長因子可通過吸引內皮細胞和刺激成骨細胞分化而調節骨的生成。Rajamannan［7］等研究發現在風濕鈣化的瓣膜有內皮生長因子的表達和成骨細胞的標記物以及局部有血管內皮生長因子和新生血管的表達。因此他們認為風濕鈣化的瓣膜不是簡單的鈣鹽在局部的沉積，而是一種成骨細胞樣骨生成改變。Kim等［8］研究發現在風濕性心臟病患者的瓣膜中轉化生長因子β(TGF－β)表達上調，而TGF－β可增強OPG mRNA的表達［9］。風濕熱引起瓣膜局部炎癥改變，大量IL和TNF等炎癥因子生成與釋放增多，可能是OPG表達上調的因素之一。此外，在炎癥愈合后，風濕細胞轉變為成纖維細胞與成骨細胞同表達OPG。而過表達的OPG又通過抑制破骨細胞的分化進一步加劇局部組織的礦化。

通過我們的研究發現在風濕鈣化瓣膜組織中，MMP－9和OPG均呈現高表達，說明風濕性心臟瓣膜鈣化與MMP－9引起的細胞外基質代謝紊亂以及OPG誘導的成骨樣骨形成密切相關，而并非簡單的鈣鹽沉積，由此提示我們是否可以通過抑制細胞外基質降解和重塑以及瓣膜的成骨樣形成，從而延緩或治療風濕性心臟病的瓣膜鈣化，為以后在風濕性心臟瓣膜病方面的研究開辟新的思路。

1 Mohsin SK，Zhang M，Clark GM，et al.Maspin expression in invasive breast cancer:association with other prognostic factors.J Pathol，2003，199:432－435.

2 Jian B，Jones PL，Li Q，et al.Matrix metalloproteinase－2 is associated with tenascin－C in calcific aortic stenosis.Am J Pathol，2001，159:321－327.

3 Kaden JJ，Vocke DC，Fischer CS，et al.Expression and acti－vity of matrix metalloproteinase－2 in calcific aortic stenosis.Z Kardiol，2004，93:124－130.

4 Fondard O，Detaint D，Lung B，et al.Extracellular matrix remodelling in human aortic valve disease:the role of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors.Eur Heart J，2005，26:1333－1341.

5 Hofbauer LC，Heofelder A E.Osteoprotegerin and its cognateligand:a new paradigm of osteoclastogenesis.Eur J Endo，1998，139:152－154.

6 Deckersmm，Bezooijen RL，Horst G，et al.Bone morphogenetic proteinsstimulate angiogenesis through osteoblast－derived vascular endothelialgrowth factor A.Endocrinology，2002，143:1545－1553.

7 Rajamannan NM，Nealis TB，Subramaniam M，et al.Calcified rheumatic valve neoangiogenesis is associated with vascular endothelial growth factor expression and osteoblast－like bone formation.Circulation，2005，111，3296－3301.

8 Kim L，Kim DK，Yang WC，et al.Overexpression of transforming growth factor－1 in the valvular fibrosis of chronic rheumatic heart disease.J Kore－an Med Sci，2008，23:41－48.

9 Thirunavukkarasu K，Miles RR，Halladay DL，et al.Stimulation of osteoprotegerin(OPG)gene expression by transforming growth factor－beta(TGF－beta).Mapping of the OPG promoter region that mediates TGF－beta effects.J Bio Chem，2001，276:36241－36250.