NCCLS評價(jià)酶循環(huán)法測定β-羥丁酸及臨床意義

丁繼紅 常文青

β-羥丁酸(beta-hydroxybutyrate)是酮體的主要成份，占酮體的78%，在肝臟內(nèi)合成，經(jīng)肝外組織利用［1］。由于β-羥丁酸在酮體中所占比例最大，所以它可代表酮體的含量。酶法測定的特異性好、檢測簡便、反應(yīng)溫和、無污染，因此β-羥丁酸測定多采用酶法。隨著臨床化學(xué)的發(fā)展出現(xiàn)了一種更加靈敏的測定技術(shù)—酶循環(huán)法，酶循環(huán)法是利用酶的底物特異性來放大靶物質(zhì)的測定方法。此法僅循環(huán)靶物質(zhì)，減少了樣品中存在的其他物質(zhì)對測定的干擾，因此不需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或?qū)Π形镔|(zhì)的提取。該法不需要專門的設(shè)備，是種前景廣闊的測定技術(shù)［2］。針對傳統(tǒng)方法學(xué)評價(jià)中的一些不足與缺陷，美國國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(national committee for clinical laboratory standards，NCCLS)制定了標(biāo)準(zhǔn)化文件，用以對臨床方法的評價(jià)。本文擬用NCCLS評價(jià)酶循環(huán)法檢測2008年3至9月來我院體檢人員和患者血清中β-羥丁酸的含量，并探討了β-羥丁酸檢測的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對照組為門診體檢健康者60例，男30例，女30例;年齡18～65歲;各項(xiàng)理化指標(biāo)均正常;糖尿病無酮癥組40例，男20例，女20例;年齡40～68歲;診斷符合WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn);糖尿病酮癥酸中毒組9例，男5例，女4例;年齡42～63歲;血糖 ＞25mmol/L，血 pH 值 ＜7.2，CO2分壓明顯降低，CO2結(jié)合力＜12mmol/L，血鈉降低，尿酮(++～+++)。

1.2 材料與方法

1.2.1 儀器與試劑:東芝TBA120FR全自動(dòng)生化分析儀;酶循環(huán)法β-羥丁酸測定試劑盒RANDOX標(biāo)準(zhǔn)品寧波亞太生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2.2 儀器參數(shù)設(shè)定:主波長500 nm，副波長700 nm，校準(zhǔn)方式線性，反應(yīng)方向上升，溫度 37℃，R1試劑 240 μl，R2試劑60 μl，樣品量 10 μl，反應(yīng)時(shí)間 10min，測定點(diǎn) 22-28，標(biāo)準(zhǔn)液濃度1mmol/L。

1.2.3 準(zhǔn)確性試驗(yàn):用RANDOX標(biāo)準(zhǔn)液做回收試驗(yàn)。取2份0.9ml的混合血清，分別加入0.1ml的 1mmol/L(樣品1)和4mmol/L(樣品2)的 RANDOX標(biāo)準(zhǔn)液，測定 β-羥丁酸的回收率。

1.2.4 精密度試驗(yàn):將1mmol/L β-羥丁酸倍數(shù)稀釋三個(gè)濃度的樣本，取高、中、低值3個(gè)不同β-羥丁酸水平樣本，每天測定2次(上午下午各1次，2次間隔時(shí)間＞3 h)每次測定均作雙份，連續(xù)測定20 d。

1.2.5 線性試驗(yàn):取4mmol/L的β-羥丁酸標(biāo)準(zhǔn)品和混合血清按 0∶4，1∶3，2∶2，3∶1、4∶0比例混合，制備 5 個(gè)不同 β-羥丁酸水平的標(biāo)本，各測定4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用NCCLS標(biāo)準(zhǔn)化文件，EPO5-A文件用于精密度評價(jià)，EP06-A文件進(jìn)行線性評價(jià)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 經(jīng)過試驗(yàn)，得出數(shù)據(jù)，見表1。

表1 樣品回收率

2.2 精密度試驗(yàn) 采用NCCLS EP05-A文件進(jìn)行精密度試驗(yàn)分析，見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 線性分析 采用NCCLS EP06-A文件進(jìn)行線性分析，本法線性回歸分析方程為 Y=1.0095 X=0.0573，r=0.9958。稀釋變異試驗(yàn)(P ＜0.05)，線性失擬檢查G(P ＜0.05)，表明β-羥丁酸在4mmol/L范圍內(nèi)線性良好。

2.4 3組臨床標(biāo)本測定 對照組和糖尿病無酮癥組標(biāo)本含量與糖尿病酮癥酸中毒組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 3。

表3 循環(huán)酶法測定3組臨床標(biāo)本結(jié)果

3 討論

正常情況下，肝內(nèi)產(chǎn)生的酮體可被肝外組織充分利用，血清中的酮體含量不高，但在糖尿病時(shí)，由于糖不能被補(bǔ)充利用，脂肪動(dòng)員加強(qiáng)，產(chǎn)生的酮體超過肝外組織的利用量，致使血清中酮體增加，產(chǎn)生酮血癥，導(dǎo)致患者酸堿失衡及電解質(zhì)紊亂，不易糾正且病死率高［3］。在2型糖尿病患者中，酮癥酸中毒非常常見，臨床上常以尿常規(guī)檢測酮體的方法進(jìn)行診斷，此法方便易行，但由于尿試紙帶中的酮體檢測模塊主要反映的是乙酰乙酸，無法與β-羥丁酸進(jìn)行反應(yīng)，而部分糖尿病酮癥酸中毒的患者早期尿液中是以β-羥丁酸為主，此時(shí)容易造成漏檢，而且當(dāng)患者無尿或腎功能嚴(yán)重?fù)p壞，腎血循環(huán)障礙，腎小球?yàn)V過率下降，此時(shí)尿酮體可減少或消失，也無法通過尿液判斷患者酮癥酸中毒的狀況。因此，測定血中β-羥丁酸對診斷糖尿病酮癥酸中毒是十分必要的。

1 雷鳴.血清β-羥丁酸的測定及臨床應(yīng)用.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2008，12:1050-1051.

2 楊昌國，許葉.酶循環(huán)法及其在酶法分析中的應(yīng)用.臨床檢驗(yàn)雜志，2009，11:310-311.

3 王冬環(huán)，趙月霞.D-3-羥丁酸檢測與臨床應(yīng)用.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，5:142-143.