丹紅注射液促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的實(shí)驗(yàn)研究

唐 昱,盛國(guó)太,鐘志英,葛郁芝

血管生成在缺血性疾病的創(chuàng)傷愈合、組織修復(fù)和再生及側(cè)支循環(huán)建立過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1,2]。探討血管新生的發(fā)生機(jī)制和研制促進(jìn)血管生成的治療方法或藥物已經(jīng)成為近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。丹紅注射液具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、縮小心肌梗死面積、抗氧化自由基、減輕心肌肥厚、改善血管內(nèi)皮功能等作用[3]。本研究應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型,觀察丹紅注射液對(duì)血管生成的影響,進(jìn)一步探討活血化瘀中藥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔,體重 2.0 kg～2.5 kg,由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。新鮮白皮種蛋重50 g～60 g,由江西省種雞廠提供。

1.1.2 藥品試劑與儀器 重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF165,英國(guó) Peprotech公司生產(chǎn)),丹紅注射液(商品名:倍通,濟(jì)南步長(zhǎng)制藥有限公司),孔徑0.45 μ m的混合纖維素微孔濾膜(上海華美生物工程公司)。數(shù)碼相機(jī)(日本索尼公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將60枚存活雞胚隨機(jī)分為生理鹽水組(N組)、正常血清組(C組)、丹紅注射液治療組(T組)、血管內(nèi)膜損傷組(I組)、血管內(nèi)膜損傷后丹紅注射液治療組(IT組)以及血管內(nèi)皮生成因子(VEGF,20 μ g/mL)組(V組),其中N 組為陰性對(duì)照組,I組為陽(yáng)性對(duì)照組,每組10枚雞胚。

1.2.2 模型制作 血管內(nèi)膜損傷模型的建立,新西蘭大白兔戊巴比妥鈉(30 mg/kg～50 mg/kg)靜脈麻醉,無(wú)菌條件下,分離右側(cè)髂總動(dòng)脈,用2.5F球囊導(dǎo)管經(jīng)右髂動(dòng)脈逆行插入腹主動(dòng)脈,(2～4)個(gè)大氣壓下,來(lái)回拖拉3次,損傷兔腹主動(dòng)脈約5 cm,再結(jié)扎右髂動(dòng)脈,縫合皮膚,術(shù)后每天給予青霉素8×105U,連續(xù) 5 d。

CAM模型的制作,新鮮白皮種蛋0.01%苯扎溴銨擦洗消毒后放入37.5℃±0.5℃恒溫箱中孵育,孵至第7天,75%酒精消毒種蛋大頭端及開(kāi)窗,滴加2滴生理鹽水使CAM下陷,與殼膜分離,制成假氣室。開(kāi)窗后第2天揭開(kāi)透明膠,將直徑為5 mm的混合纖維素微孔濾膜小碟放于兩條前卵黃靜脈之間的相對(duì)無(wú)血管的 CAM 上,分別加5 μ L各待測(cè)物,每24 h加1次,連續(xù)加3 d。孵育第11天,揭去透明膠,向假氣室內(nèi)加入10%甲醛,固定20 min,剪下CAM,平鋪于加有固定液的玻璃平皿中繼續(xù)固定,數(shù)碼相機(jī)拍照,并將CAM平鋪于載玻片上,陰干保存。

1.2.3 血清的制備 丹紅注射液治療組及血管內(nèi)膜損傷后丹紅注射液治療組均于大白兔耳緣靜脈注射丹紅注射液2 mL/kg,共治療7 d。正常血清組和血管內(nèi)膜損傷組注射等劑量的純凈水。第8天從兔耳緣靜脈采取靜脈血4 mL,在無(wú)抗凝劑的試管中離心,取血清并分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血管計(jì)數(shù) 在自然光線(xiàn)下,以慮紙為背景,用數(shù)碼相機(jī)拍照,在顯微鏡(×10倍)下計(jì)載體邊緣的血管數(shù)目。根據(jù)管徑將血管分為3類(lèi):＞0.1 mm為大血管;0.1 mm～0.05 mm為中血管;＜0.05 mm為小血管。凡屬趨向性生長(zhǎng)的血管,即以載體為中心發(fā)出,與濾膜半徑的夾角小于45度者均予計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)載體周?chē)?.5 cm內(nèi)的血管分支點(diǎn)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 雞胚發(fā)育觀察 雞胚在溫度37.8℃、濕度40%～70%條件下正常發(fā)育。通過(guò)照卵燈連續(xù)觀察胚膜發(fā)育情況,可見(jiàn)櫻桃珠(2日胚)、蚊蟲(chóng)珠(3日胚)、蜘蛛胚(4日胚)等特征,絨毛尿囊膜透明,血管豐富,脈絡(luò)清晰,生成情況與孵育時(shí)間相吻合。

2.2 各組對(duì)雞胚血管生成的影響 生理鹽水組載體周?chē)軘?shù)量較少,呈正常的樹(shù)枝狀分布。治療組血管以載體為中心呈輻輳狀生長(zhǎng),血管數(shù)量明顯增多。與生理鹽水組比較,正常血清組血管生成數(shù)量無(wú)明顯差異。血管VEGF組血管生成數(shù)量明顯多于生理鹽水組及正常血清組丹紅注射液治療組血管生成數(shù)明顯高于正常血清組,與血管VEGF組相似。血管內(nèi)膜損傷后血清組血管生成現(xiàn)象與VEGF相似,血管以載體為中心呈輻輳狀生長(zhǎng),且可見(jiàn)血管吸引現(xiàn)象。血管生成數(shù)量不僅明顯多于正常血清組,而且較血管VEGF組也明顯更多,大、中血管數(shù)也較正常血清組及血管VEGF組明顯增多。然而,血管內(nèi)膜損傷后丹紅注射液治療組與血管內(nèi)膜損傷組相比,兩組血管生成數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 各組CAM上載體周?chē)难苡?jì)數(shù)比較(±s)條

表1 各組CAM上載體周?chē)难苡?jì)數(shù)比較(±s)條

組別 大血管 中血管 小血管 血管總數(shù)生理鹽水組 1.5±0.5 3.5±1.1 20.4±3.9 25.4±3.9正常血清組 2.2±1.0 4.5±0.9 21.4±3.2 28.6±3.2血管VEGF組 3.6±0.91) 4.9±1.2 24.3±2.4 33.9±3.1丹紅注射液治療血清組 3.0±1.02) 4.6±1.2 24.1±2.7 31.8±3.0內(nèi)膜損傷血清組 6.7±1.22) 6.1±1.52) 25.9±2.22) 38.7±3.1內(nèi)膜損傷丹紅治療組 9.8±1.83) 10.5±2.94) 19.6±5.6 39.1±3.5與正常血清組比較,1)P＜0.05;與血管 VEGF組比較,2)P＜0.01;與丹紅注射液治療血清組比較,3)P＜0.01;與內(nèi)膜損傷血清組比較,4)P＜0.05

3 討 論

丹紅注射液為丹參和紅花的提取物,具有行氣活血、解郁化瘀、養(yǎng)血通脈的功效。本研究采用丹紅注射液直接靜脈給藥取血,避免了傳統(tǒng)給藥途徑所造成的外界因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,同時(shí)也較好地控制了血藥濃度。

慢性缺血性心腦血管疾病因供氧和需氧之間失去平衡,如能促進(jìn)新生血管生成,可以增加細(xì)胞血液供應(yīng),改善功能,減少細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)觀察到血管內(nèi)膜損傷后兔血清具有明顯的促血管生成作用,其效應(yīng)好于20 μ g/mL濃度的VEGF。實(shí)驗(yàn)表明血管內(nèi)膜損傷可以通過(guò)機(jī)體動(dòng)員作用,產(chǎn)生多種促血管生長(zhǎng)因子,如:VEGF、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)是血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等多種細(xì)胞因子[4]。血管損傷兔血清可明顯促血管生成,作用與促血管生長(zhǎng)因子的濃度明顯增高有關(guān)。含丹紅注射液的兔血清具有明顯的促雞胚絨毛尿囊膜血管生成的作用。血管生成受到多種生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié),其中VEGF和bFGF是血管生成過(guò)程中的兩個(gè)最重要的生長(zhǎng)因子。它們?cè)谡T導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)抗凋亡蛋白,動(dòng)員骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)入外周循環(huán)并定位到缺血組織等方面發(fā)揮重要作用[5,6]。

本實(shí)驗(yàn)兔血管內(nèi)膜損傷后,丹紅注射液治療組呈現(xiàn)更為明顯的促血管生成作用。究其原因,可能與血管損傷[7]及切口愈合[8,9]激活機(jī)體自身產(chǎn)生的多種促血管生長(zhǎng)因子具有強(qiáng)大的促血管新生作用,而丹參多酚酸鹽是丹參的水溶性有效活性部位,對(duì)培養(yǎng)的人單核細(xì)胞通過(guò)對(duì)VEGF、bFGF釋放及其mRNA的表達(dá)促進(jìn)作用,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移等機(jī)制有關(guān)[5]。為闡明這一點(diǎn),在血管損傷后更長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)采取血清進(jìn)行研究,可望得到更有價(jià)值的資料。

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