細辛腦注射液對槐定堿致癇大鼠Caspase3及熱休克蛋白-70表達的影響1)

甄軍麗,王維平

在眾多癲癇模型中,點燃癲癇模型類似臨床患病的癲癇發作,是人們最為感興趣的癲癇模型之一,其中戊四氮腹腔注射所致SD大鼠慢性點燃模型較為常見,而對槐定堿致癇模型較少報道。本實驗應用大劑量槐定堿致癇,觀察大鼠腦內Caspase3及熱休克蛋白-70(hsp-70)含量的變化,探討細辛腦注射液對致癇大鼠抗癲癇的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠42只,雄性,體重

180 g±20 g,SPF級,由河北醫科大學實驗動物中心提供,實驗動物批準號:DK0505-0158。

1.2 藥物、試劑與儀器 槐定堿(sophoridine,SR)由寧夏藥物研究所提供,批號:991230;細辛腦注射液,購于桂林南藥股份有限公司,國藥準字H45021202;卡馬西平由上海第六制藥廠提供;一抗購于santa cruz biotechnology;二抗由中杉生物工程有限公司提供;冰凍切片機(德國 LEICA RM-2135);研究用生物顯微鏡(日本OLYM PUS BX60);CMIAS系列數碼醫學圖像分析系統(中國M otic Med 6.0);染色劑甲苯胺藍(購于上海生化試劑有限公司)。

1.3 方法 42只大鼠隨機均分為6組,每組7只,分別為空白組、模型組、卡馬西平對照組、細辛腦高劑量組、細辛腦中劑量組、細辛腦低劑量組。其中空白組、模型組予飼雙蒸水2 mL/d,卡馬西平對照組給予卡馬西平10 mg/(kg?d),細辛腦組高、中、低劑量組濃度按9 mg/kg、5 mg/kg、2 mg/kg配制,分別飼藥10 d。第11天除空白組外均予槐定堿11 mg/kg腹腔注射,對大鼠進行行為學觀察,于 24 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,開胸暴露心臟,升主動脈插管,以生理鹽水250 mL和4%多聚甲醛固定30 min后,迅速取出全腦,沿腦正中矢狀切開,取大腦于相同固定液中固定24 h(4℃),次日以30 μ m 厚度進行冰凍切片,行連續冠狀切片,一半用于檢測皮質和海馬的Caspase3及 hsp-70表達情況;另一半行 Nissle染色,中性樹膠封片,高倍鏡(X400倍)下觀察。

1.4 觀察項目 參考Racine癲癇發作分級標準觀察大鼠癲癇發作分級并記錄;行腦組織Nissle染色法,觀察皮質和海馬的神經元丟失或壞死情況;運用CMIAS系列數碼醫學圖像與分析系統記錄各組Caspase3及hsp-70陽性細胞密度。

1.5 大鼠驚厥發作評分標準 參考Racine癲癇發作分級標準,0級:無反應;Ⅰ級:節律性嘴和面部抽動或洗臉;Ⅱ級:點頭或甩尾;Ⅲ級:單肢抽動;Ⅳ級:多肢抽動和強直;Ⅴ級:全面性強直陣攣發作。

1.6 統計學處理 運用SPSS 13.0軟件處理數據結果,采用Ridit、方差分析。

2 結 果

2.1 大鼠行為學觀察(見表 1)

表1 各組大鼠腹腔注射槐定堿后癲癇發作情況 只

2.2 腦組織形態學變化 Nissle染色結果顯示,細辛腦中、高劑量組、空白組和卡馬西平對照組腦組織幾乎呈均勻一致的紫藍色,細胞密度大,神經元形態結構完整,為三角形、長條形或多邊形,胞漿染色清晰,尼氏體著藍色,胞核淡然,海馬 CA1區錐體細胞3層～4層,形態規則,未見明顯神經元丟失;槐定堿模型組可見神經元皺縮體積縮小,與周圍組織有脫離,胞核深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,多數胞漿呈空泡狀,海馬CA1區細胞排列散亂,無層次感,尼氏體減少,部分神經元丟失,細胞密度小;細辛腦小劑量組可見較多神經元腫脹,少量神經元皺縮,胞核深淺不均,細胞密度較大,與模型組比較,神經元損傷減輕、丟失減少,提示細辛腦治療組對癲癇后神經元損傷具有一定的保護作用。

2.3 Caspase3及hsp-70含量(見表 2)

表2 各組Caspase3及hsp-70陽性細胞(±s)/100 g

表2 各組Caspase3及hsp-70陽性細胞(±s)/100 g

組別 n Casepase3 hsp-70空白組 7 5.94±2.13 1.39±1.22模型組 7 23.04±2.26 18.77±2.24卡馬西平對照組 7 15.83±2.891) 7.39±1.691)細辛腦低劑量組 7 13.46±3.011) 6.07±2.051)細辛腦中劑量組 7 9.86±2.781) 5.54±1.381)細辛腦高劑量組 7 7.98±2.761) 2.49±1.571)與模型組比較,1)P＜0.05

3 討 論

癲癇的病因病機十分復雜,中醫學認為,本病多由先天稟賦受損,氣血瘀滯,或驚恐勞傷過度,肝、脾、腎三臟功能失調,使痰壅風動,上擾清竅而發病。發病初期多正盛邪實,日久必損傷正氣,痰濁、瘀血等邪實沉痼,形成虛實夾雜。因“壯火食氣”亦可導致氣虛;肝風痰濁日久亦可出現木旺克脾土,致脾虛水濕失運,痰濁內生,脾虛痰盛日久,氣血生化乏源則可致心血不足,中焦氣機失運;又因“精血同源”,日久必累及肝腎之陰精而成肝腎陰虛證?？梢姳静〔∽兣K腑以心肝脾腎為主,病理特點為本虛標實、虛實夾雜。治療大法當以扶正祛邪,標本兼顧。本品是中藥石菖蒲的主要有效成分,臨床上常用于成人和兒童細菌性肺炎、肺內感染、急慢性支氣管炎、支氣管哮喘、阻塞性肺氣腫、肺心病、支氣管擴張及支氣管肺癌以及感冒引起的咳嗽、咯痰、喘息。最新研究認為本品對癲癇發作有顯著療效,其可能的機制是:α細辛腦能提高大腦皮層的點刺激閾,抑制電刺激的突觸傳導及癇性放電。以石菖蒲為君藥,祛痰濁風邪,兼具開竅啟閉、祛風止痙之功效。

本實驗選擇了大劑量槐定堿(11 mg/kg)制作大鼠癲癇模型,可使神經元過度興奮,引起動物Ⅲ級及以上癲癇發作,且發作頻繁,可持續0.5 h以上。這個模型類似于癲癇部分性發作。張琳娜等[1]實驗表明,槐定堿2.94 mg/kg可明顯抑制青霉素致癇大鼠皮層癲癇樣放電,使潛伏期明顯延長,改善神經元細胞損傷和清除氧自由基,具有一定的抗癲癇作用,而槐定堿5.88 mg/kg和11.76 mg/kg卻可加強癇樣發作。提示槐定堿可能具有雙向調節性,對于不同劑量槐定堿對中樞活動的不同影響和作用機制還有待于進一步研究。

Caspase家族目前已發現 14個成員,其核心成員為Caspase3。該蛋白酶于1994年由Fernandes從人T細胞系首次克隆,因編碼相對分子質量為32×103的半胱氨酸蛋白酶又稱CPP32[2]。結構分析發現人類Caspase3全長氨基酸序列與介導線蟲凋亡的Ced3蛋白的相似性最高,被認為是Ced3在哺乳動物中真正的對應者。Caspase3所作用的底物多為維持細胞生命活動的重要功能蛋白,分別參與DNA修復、mRNA裂解和細胞骨架重建。多種多樣的刺激因素啟動的信號激活Caspase3,引起多效基因變化,使細胞質、細胞核及細胞骨架的重要蛋白質降解失活[3,4],從而導致細胞不可逆性地走向凋亡,這為進一步研究癲癇發作與細胞凋亡的分子機制提供了實驗工具和基礎。Gillardon采用原位雜交檢測了由海人藻酸誘發的癲癇大鼠的海馬組織,發現海馬組織存在Caspase3基因表達和凋亡神經元,因而推測可能是神經元癲癇樣放電的興奮性毒性導致Caspase3的激活表達和海馬神經元的凋亡丟失[5]。本實驗發現,癲癇樣放電導致神經元凋亡丟失,Caspase3參與介導了該凋亡過程,由此設想,或許將來通過阻止Caspase3表達或抑制Caspase3活性這一策略可以挽救凋亡神經元,延緩海馬硬化的進程。

而hsp-70是機體在遭受各種刺激后,誘導產生的一組應激蛋白。hsp-70是熱休克蛋白(稱為“分子伴侶“或”伴侶蛋白”)中最保守和最主要的一類[6],在細胞應激后生成最為顯著,被認為對神經元損傷具有保護作用。當神經元受損時,hsp-70表達后分別在胞漿和胞核中同變性蛋白結合,防止變性蛋白進一步折疊,促使其恢復或加速其降解和消除,維持神經元內蛋白自穩,以維護細胞的功能和生存。目前,神經元受損時,hsp-70表達對受損神經元的保護作用已基本肯定[7],因此,hsp-70在腦內表達的速度及數量在一定程度上影響神經元對癲癇興奮性損傷的耐受性,并可能是癲癇腦內神經元選擇性脫失的內在機制之一。

本實驗中細辛腦注射液對槐定堿致癇大鼠腦組織中caspase3及hsp-70的合成有明顯抑制作用,能夠顯著控制癲癇發作,減輕神經元在癲癇發作時的興奮性損傷。該藥物對癇性發作后Caspase3及hsp-70的表達相協調,這和鄭虹等[8]對兩者在腫瘤方面的研究報道有些不一致,可能與癲癇發作的持續時間和程度有關。究竟凋亡和應激蛋白的表達之間是否具有相關性,具體作用機制和作用途徑尚有待進一步去研究。

[1]張琳娜,陳曉霞,李玉香,等.槐定堿對青霉素致癇大鼠中樞活動的影響[J].寧夏醫學院學報,2008,30(6):703-705.

[2]Fernandes AT,Litwack G,Alnemri ES.CPP32,a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta converting enzyme[J].J Biol Chem,1994,269(49):30761-30764.

[3]Song Q,Lees Miller SP,Kumar S,et al.DNA dependent protein kinasecatalytic subunit:A target for an ICE like protease in apoptosis[J].EMBOJ,1996,15(13):3238-3246.

[4]Waterhouse N,Kumar S,Song Q,et al.Heteronuclear ribonucleoproteinsC1 and C2,components of the spliceosome,are specific targets of interleukin 1 beta converting enzy me like proteases in apoptosis[J].J Biol Chem,1996,271(46):29335-29341.

[5]Gillardon F,Bottiger B,Schmitz B,et al.Activation of CPP-2 protease inhippocampal neurons following ischemia and epilepsy[J].Brain Res MolBrain Res,1997,50(1-2):16-22.

[6]周純,黃常志.熱休克蛋白70與腫瘤[J].國外醫學:腫瘤學分冊,1997,24(5):257.

[7]Plumeir JC.Transgenic mice expresinge human in ducilbe HSP70 have hippocampal neurons resistant to ischemic injury[J].Cell Stress Chaperones,1997,2(3):162-168.

[8]鄭虹,耿明.HSP70、Caspase3在膠質細胞瘤中的表達及與腫瘤病理分級的關系[J].山東大學學報,2007,45(9):944-946.