長托寧對癲癇持續狀態大鼠海馬神經元保護作用研究

霍 瑩,鄭輯英,李光來,薛國芳,牛海雁

癲癇持續狀態(SE)是神經科的急癥,臨床和動物實驗都證實,SE會導致認知、行為的改變,嚴重時會直接導致死亡。研究表明,SE后引起的細胞凋亡是癇性腦損傷的重要環節之一。因此,抑制細胞凋亡的發生,對防治SE導致的腦組織損傷具有重要的臨床意義。長托寧是一種新型的腦保護劑,有報道顯示[1],長托寧可以減輕缺血/再灌注時腦組織損傷,起到腦保護作用。但長托寧對SE導致的腦損傷是否有保護作用尚未見研究報道。本實驗旨在觀察SE后大鼠腦組織凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2的表達情況,探討長托寧干預對SE導致的神經元損傷的影響及其可能機制,以期為長托寧應用于臨床SE的治療提供可能的動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠54只,體重180 g～220 g,由山西醫科大學生理教研室動物中心提供;氯化鋰購自中國醫藥集團上海試劑公司;匹羅卡品購自美國Sigma公司;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體、TUNEL試劑盒、即用型SABC試劑盒均系武漢博士德公司產品;DAB試劑由北京中杉金橋生物技術有限公司出品;長托寧系成都力思特制藥股份有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 54只Wistar大鼠隨機分為A組(對照組)6只,B組(模型組)和C組(長托寧組)各24只,后兩組按時間點分為4個亞組(6 h,12 h,24 h,48 h)。

1.2.2 動物模型制備 C組在造模前15 min腹腔注射長托寧2 mg/kg,24 h和 48 h亞組每12 h重復1次,劑量同前。A組、B組于相對應時間給予等量生理鹽水。15 min后B組、C組腹腔注射氯化鋰127 mg/kg,18 h后再注射新鮮配制的匹羅卡品30 mg/kg制備SE模型;A組腹腔注射等量的生理鹽水。觀察大鼠出現癇性發作的時間和表現,使之持續1 h,然后腹腔注射地西泮10 mg/kg以終止癇性發作。驚厥評分采用Racine評分法,出現3級以上發作提示造模成功,造模過程中大鼠出現死亡或不符合模型要求者,予以剔除并隨機補充,以保證每組動物6只。

1.2.3 標本處理 在SE后相應時間點各取大鼠6只,用25%烏拉坦4 mL/kg深麻醉后,斷頭取腦,大鼠腦組織置入4%多聚甲醛中固定,常規脫水、透明、浸蠟、包埋后,在視交叉后海馬區連續冠狀切片,片厚 5 μ m,每隔15張連續取 4張,相鄰切片分為四套,分別進行各指標的檢測。HE染色,光鏡下觀察形態學變化。

1.2.4 細胞凋亡檢測 采用T UNEL法檢測,按試劑盒(POD)提供的方法進行操作,細胞核中有棕黃色顆粒者即為陽性細胞,即凋亡細胞。

1.2.5 Caspase-3及Bcl-2蛋白免疫組化檢測 免疫組化步驟參照試劑盒推薦方法進行(常規SABC法,DAB染色)。胞漿或核膜染色呈棕黃色為蛋白陽性表達。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計分析軟件,兩組間的比較采用t檢驗,多組間的比較采用方差分析,檢測結果以均數±標準差(±s)表示。

2 結 果

2.1 行為學表現 B組大鼠注射匹羅卡品后15 min～30 min均出現流涎、點頭、洗臉樣動作;隨后出現前肢陣攣,之后很快表現為前肢陣攣伴站立,進一步發展到全身強直陣攣發作伴站立、摔倒,反復發作,均達到Ⅳ級～Ⅴ級發作,呈癲癇持續狀態,點燃率為100%;C組大鼠也均達到癲癇持續狀態,但潛伏期較長且癇性發作程度較B組輕,多在Ⅲ級～ Ⅳ級發作;A組大鼠無癲癇發作。

2.2 HE染色結果 A組神經元排列整齊緊密,胞漿透明,細胞核呈圓形或橢圓形,染色質分布均勻,核仁清晰;B組出現了嗜酸性神經元,表現為細胞排列紊亂,胞體收縮呈三角形或極不規則,胞漿紅染、胞核明顯固縮;C組也出現嗜酸性神經元,但排列尚整齊,形態接近正常。

2.3 細胞凋亡檢測 A組僅有少量TUNEL陽性細胞表達,呈散在分布,著色較淺;B組6 h時TUNEL陽性細胞表達開始增多,并隨時間點的延長而增加,24 h達高峰,48 h減少,與B組相比,C組TUNEL陽性細胞仍在24 h達高峰,但相應時間點TUNEL陽性細胞的表達均低于B組,差異有統計學意義(除6 h外,P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠海馬T UNEL陽性細胞數比較(±s)個

表1 各組大鼠海馬T UNEL陽性細胞數比較(±s)個

組別 6 h 12 h 24 h 48 h A組 2.09±0.33 B組 14.71±1.431) 28.33±1.731)36.16±1.831) 27.46±1.451)C組 13.38±1.41 18.53±1.292)27.58±1.422) 19.41±1.392)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05

2.4 Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達 A組可有Bcl-2、Caspase-3微量的基礎表達;B組與 A組比較,6 h時 Bcl-2和Caspase-3表達開始增強(P＜0.05),12h時,Bcl-2達高峰(P＜0.05),Caspase-3顯著增強(P＜0.05);24 h Bcl-2開始減弱(P＜0.05),Caspase-3達峰值(P＜0.05),48 h二者均繼續減弱(P＜0.05)。C組與B組比較,除 6 h外,各時點 Bcl-2和Caspase-3表達差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見表 2、表3。

表2 各組大鼠海馬Bcl-2免疫反應陽性細胞數(±s)個

表2 各組大鼠海馬Bcl-2免疫反應陽性細胞數(±s)個

組別 6 h 12 h 24 h 48 h A 組 10.35±1.08 B組 25.34±1.251) 39.94±1.751)33.09±2.051) 25.69±1.501)C組 26.56±1.49 50.18±1.742)46.46±2.832) 41.56±1.392)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05

表3 各組大鼠海馬Caspase-3免疫反應陽性細胞數(±s)個

表3 各組大鼠海馬Caspase-3免疫反應陽性細胞數(±s)個

組別 6 h 12 h 24 h 48 h A組 1.70±0.29 B組 10.23±1.491) 18.45±1.501)30.87±2.501) 24.27±1.841)C組 9.44±1.35 12.33±1.402)18.42±1.592) 15.67±1.392)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05

3 討 論

SE后神經元的損傷機制一直是近年來的研究熱點,形態學和生化的方法均證實,SE后神經元死亡具有典型的凋亡特征。Bcl-2和Caspases蛋白家族是最主要的凋亡調控基因。Bcl-2是第一個被認為可以抑制細胞凋亡的基因,它可以阻止細胞凋亡的發生,延長細胞生存,被稱為細胞長壽基因[2]。氯化鋰-匹羅卡品誘發SE后Bcl-2表達異常,證實Bcl-2參與了SE后神經元損傷的調控[3]。隨著對凋亡研究的深入,Caspase-3越來越引起人們的關注。細胞凋亡過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程,Caspase-3是Caspase級聯反應中下游最關鍵的凋亡執行蛋白酶,在凋亡程序中起最后樞紐作用[4]。有研究發現[5],6周齡的SD大鼠,在腹腔注射匹羅卡品出現SE后1 h處死,免疫陽性Caspase-3陡然升高(與對照組相比),證實Caspase-3在癲癇引起的神經元凋亡機制中確實發揮了重要的作用。本實驗研究結果顯示,A組僅有Bcl-2、Caspase-3基礎量的表達,B組Bcl-2于SE后6h升高,12 h達高峰,48 h減少;而Caspase-3在SE后6 h升高,24 h達峰值,這與TUNEL陽性細胞的表達基本一致,進一步證明Bcl-2抑制神經細胞凋亡,而Caspase-3促進細胞凋亡。C組各時間點TUNEL、Caspase-3陽性細胞較B組減少(除6 h外均 P＜0.05),而Bcl-2陽性細胞數增加(除 6 h外均 P＜0.05),表明長托寧能夠通過上調 Bcl-2、下調Caspase-3,從而產生抗細胞凋亡作用。

近年來,抗膽堿能藥物作為一種新型的腦保護劑越來越得到人們的關注。有研究表明[6],抗膽堿能藥物可以通過穩定細胞膜、抗氧自由基損傷、減少鈣超載、抑制興奮性氨基酸釋放、抑制一氧化氮(NO)釋放、促進熱休克蛋白70(HSP70)表達等方式,從而發揮對神經元的保護作用。長托寧(鹽酸戊乙奎醚注射液)是一種新型的抗膽堿藥物,具有抗膽堿作用強而全面,副反應少,半衰期長,易通過血腦屏障的特點,臨床和動物實驗均證實長托寧具有較強的腦細胞保護作用。本實驗研究表明,預先給予長托寧能延遲SE出現的時間,并減輕癲癇發作級別以及神經元的損傷程度,長托寧可能通過上調SE時大鼠腦組織Bcl-2的表達和抑制Caspase-3產生,從而發揮神經元保護作用。長托寧的腦保護機制是多途徑、多位點的,筆者將做進一步探討。

[1]曹鋒生,韓繼媛,田兆興.長托寧對大鼠急性全腦缺血再灌注后NF-κ B的影響[J].嶺南急診醫學雜志,2006,11(1):7-9.

[2]Konturek PC,Konturek SJ,Sulekova Z,et al.Expression of hepatocyte growth factor,transforming growth fact or alpha,apoptosis related proteins bax and bcl-2,and gastrin in human gastric cancer[J].Aliment Pharma col T her,2001,15:989-999.

[3]岳宏,鄭輯英、李光來,等.塞來昔布對大鼠癲癇持續狀態海馬神經元凋亡及Bcl-2表達的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志,2008,6(4):436-438.

[4]Zhu C,Wang X,Xu F,et al.The influence of age on apoptotic and other mechanisms of cell death after cerebral hypoxia-ischemia[J].Cell Death Differ,2005:12(2):162-176.

[5]溫曉妮.促紅細胞生成素預處理對鋰-匹羅卡品誘導的癲癇持續狀態大鼠海馬神經元凋亡的影響[J].陜西醫學雜志,2008,8(37):954-956.

[6]曹鋒生,韓繼媛.抗膽堿能藥防治缺血再灌注損傷的研究進展[J].醫藥導報,2006,25(9):931-933.