無脊椎動物促性腺激素釋放激素研究進展

于新秀，遲長鳳，吳常文

(浙江海洋學院，浙江省海洋養殖裝備與工程技術重點實驗室，浙江舟山 316000)

20世紀70年代初SCHALLY和GUILLEMIN等分別用豬和牛下丘腦分離出1種十肽，分析出肽鏈組成為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，并證明它能使垂體釋放促黃體生成素故稱其為促黃體生成素釋放激素(luteining hormone releasing hormone,LHRH)[1]。后來的實驗發現LHRH也能促使腺垂體釋放促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)，故又稱之為促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)。它是下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonad，HPG）軸的關鍵信息分子，在性腺發育、性成熟和繁殖功能的維持中起至關重要的調節作用。

GnRH不僅存在于脊椎動物中，也存在于無脊椎動物中。這說明GnRH是一種古老的生殖激素，在脊椎動物出現以前就已經存在；且其生殖調控的功能即使在無垂體的無脊椎動物中，經歷了5億3千萬年的進化中幾乎沒有改變[2]。

GnRH調節促性腺激素的合成與釋放，從而調控生殖發育，研究其對生殖腺的表達調控機制，誘導排卵以及調節生殖腺的發育程度具有重要意義。另外，探索可作為神經激素、神經遞質、神經調質的GnRH，還有助于改進的GnRH特異激動劑和拮抗劑的分子設計，生產出更多的GnRH類似物，用于養殖動物的人工繁殖。用已經鑒定的GnRH抗體對動物的神經系統(腦和神經管)和性腺進行免疫組織化學定位觀察，可以為了解GnRH的存在物種，為GnRH在動物生殖內分泌調控中的作用機制提供形態學依據。用分子克隆的方法在分子水平上研究GnRH，獲得其核苷酸序列，為GnRH的進化地位提供了更為確鑿的證據。總之，深入研究GnRH，無論是對脊椎動物還是無脊椎動物都具有十分重要的意義。

1 無脊椎動物中的GnRH及其類似物

首先在高等的脊索動物中發現GnRH的存在，隨后用免疫組織化學的方法漸漸在無脊椎動物中檢測到該肽或其類似物。這改變了曾經一度認為GnRH僅存在于脊索動物的觀點，掀起了在無脊椎動物中研究GnRH的熱潮。

在過去的十幾年中，越來越多的研究者在無脊椎動物中發現GnRH及其類似物，為無脊椎動物中GnRH的普遍存在奠定了基礎，也進一步證明GnRH是一種古老的肽，在由低等的無脊椎動物向高等脊椎動物進化的過程中，GnRH對動物的生殖調控活動都起著重要作用。

GnRH的研究已取得重大進展，目前已至少發現28種類型的GnRH，其中15種來自脊椎動物，13種來自無脊椎動物[3]，每個GnRH類型都是以最先鑒別出的動物命名的。在無脊椎動物鑒別出的13種GnRH種類型中，有10種出現在尾索動物的2種海鞘中，還有另外3種出現于軟體動物的真蛸Octopus vulgaris、商烏賊Sepia officinalis和海兔Aplysia californica中。

另外，研究者還通過免疫反應等方法在頭索動物、半索動物、棘皮動物、節肢動物、扁形動物、線蟲動物、刺胞動物等中發現GnRH或其類似物的存在，甚至有學者發現酵母的ɑ-接合因子不僅在結構上與mGnRH同源，而且具有mGnRH的活性，能夠刺激哺乳動物垂體LH和FSH的分泌[4]。從而可以推測出GnRH在漫長的動物進化中結構和功能都具有相當的保守性。所有這些研究為無脊椎動物中GnRH的研究奠定了堅實的基礎。在這些研究中，除去尾索動物亞門中的被囊動物外，軟體動物的GnRH研究相對來說更為深入，已經鑒定出2種GnRH，均為十二肽的氨基酸序列，本文也重點闡述軟體動物中的GnRH的結構和功能研究。

1.1 軟體動物Mollusca

1.1.1 頭足類Cephalopoda

DI COSMO等[5]1998年在真蛸視腺中發現GnRH活性。2002年IWAKOSHI等[6]從Octopus vulgaris的腦中分離出1個十二肽，結構類似于脊椎動物的GnRH，具有其保守的N-末端和C-末端，并將其命名為oct-GnRH。分布在中樞神經的食管上神經節和食管下神經節、小腦復合物以及視腺中，另外在鰓心、輸卵管、纏卵腺等處也發現了其免疫活性。oct-GnRH在日本鵪鶉Coturnix coturnix中表現出促黃體生成素釋放激素的活性，證明oct-GnRH具有脊椎動物的GnRH活性。這是第一次在軟體動物中鑒定出GnRH的結構。IWAKOSHI-UKENA等[7]還發現GnRH具有除生殖調控之外的其他功能，可能作為一個調控因子調節腦的更高級活動，例如攝食、運動、記憶等，oct-GnRH可以調節食管的運動，影響口球的攝食活動，可以調節輸卵管和心的伸縮，還可以作為神經調質，影響視覺和觸覺。2006年，KANDA等[7]還發現oct-GnRH的受體包含脊椎動物GnRH受體的典型結構域。所有的這些足以證明oct-GnRH屬于GnRH家族。

RASTOGI等在槍烏賊Loligo vulgaris的中樞神經和視腺中發現mGnRH的免疫活性。2009年DI CRISTO，DE LISA，DI COSMO研究發現商烏賊Sepia officinalis的GnRH前體cDNA與oct-GnRH的閱讀編碼框ORF完全相同[9]。這些研究都為其他頭足類如曼氏無針烏賊Sepiella maindroni等GnRH的研究提供了寶貴的參考價值。

1.1.2 多板綱Polyplacophora

2003年，GORBMAN等[10]在海水中加入不同濃度的不同種類的GnRH，觀察對石鱉Mopalia sp配子釋放的影響。結果七鰓鰻lGnRH-Ⅲ、被囊動物tGnRH-Ⅰ以及cGnRH-Ⅱ對其配子的釋放沒有影響，而lGnRH-Ⅰ和tGnRH-Ⅱ在濃度為1.0 mg/L時，能夠刺激成熟配子的釋放，在較低的濃度50 μg/L時則沒有影響[9]。這說明石鱉的GnRH類似物與lGnRH-Ⅰ和tGnRH-Ⅱ相似，而且其特定受體，可以與這兩種GnRH很好地結合。

1.1.3 腹足類Gastropod

1993年GOLDBERG等[11]第一次在軟體動物中檢測到GnRH的存在，他們使用mGnRH和cGnRH-Ⅱ兩種抗體，主要在田螺Helisoma trivolvis的腦和足神經節檢測到mGnRH的免疫活性，而在體壁和內臟神經節檢測到cGnRH-Ⅱ活性，并且將Helisoma trivolvis的中樞神經的提取物作用于金魚，會刺激金魚的垂體釋放促性腺激素。1999年，YOUNG等[12]又發現腹足類中的靜水椎實螺Lymnaea stagnalis存在GnRH免疫活性。還有學者根據貓頭鷹帽貝Lottia gigantea的GnRH前體cDNA推測GnRH序列長度為15個氨基酸[13]。

2009年，NUURAI等[3]在成熟雌性耳鮑Haliotis asinina L的神經節和卵巢中用免疫組織化學的方法檢測到七鰓鰻lGnRH-Ⅲ和被囊動物tGnRH-Ⅰ。lGnRH-Ⅲ大量分布于腦神經節和側足神經節的神經分泌細胞NS1（大小約為10 μm×10 μm）以及腦神經節的小型神經分泌細胞NS2中，還存在于卵巢中的卵原細胞和Ⅰ期卵母細胞中。tGnRH-Ⅰ同樣存在于腦神經節和側足神經節背部的神經分泌細胞NS1,以及腹部的長神經纖維中，在卵巢的Ⅰ期卵母細胞和部分Ⅱ期卵母細胞中也有發現。由此得出的結論是神經組織中的GnRH起著信號傳遞的作用，且推測卵巢中的GnRH可能形成于卵巢，起著自分泌或旁分泌的作用，直接誘導卵細胞的發育。

ZHANG等[14]從海兔Aplysia californica的中樞神經系統中獲得GnRH類似物ap-GnRH的cDNA全長，閱讀編碼框（ORF）可以編碼147個氨基酸，其中ap-GnRH具有12個氨基酸。Aplysia californica是腹足類中第一個確定到GnRH的分子結構的物種。比較ap-GnRH與oct-GnRH的前體發現：具有共同的分子結構，都具有信號肽、十二肽的GnRH以及GnRH相關蛋白（GAP），這與脊椎動物的GnRH前體一致。GAP區的相似度為37.2%，而GnRH的相似度為83.3%，這種選擇性的保守使不同物種中的GnRH的功能基本不變[14，15]。

陳蕾、鄧陳茂、梁飛龍等[16-18]利用免疫組織化學SABC法和SP法發現合浦珠母貝生殖腺及消化道既能分泌GnRH又能表達其受體，說明GnRH可能通過自分泌或旁分泌作用來調節合浦珠母貝的繁殖及消化功能，這些發現為以后GnRH在合浦珠母貝人工育苗方面的應用奠定了基礎。

1.1.4 雙殼綱Bivalvia

FRANCK等[19]在太平洋牡蠣Crassostrea gigas的生殖腺中檢測到GnRH的受體，并進行了克隆與表達分析，其氨基酸序列與脊椎動物生物受體高度相似。由此推測其體內也可能存在GnRH的類似物。紫貽貝Mytilus edulis和扇貝中也發現GnRH的存在。

1.2 其他無脊椎動物中的GnRH[20]

1.2.1 頭索動物Cephalochordata

SCHRIEBMAN等1986年在文昌魚Branchiostoma belcheri發現GnRH活性[21-24]。GnRH免疫活性細胞分布在文昌魚的端腦前端和靠近中腦的背部，中腦中部及哈氏窩中。

1.2.2 尾索動物Urochordata

已在被囊動物中發現10種GnRH的不同形式，且結構均已獲得鑒定。除去GnRH-Ⅹ為十六肽外，其余均為十肽。免疫組化法發現它分布于腦和中樞神經系統及其周圍。

1.2.3 半索動物門Hemichordate

已經在Saccoglossus bromophenolosus和Ptychodera bahamensis中發現GnRH的活性，tunicate GnRH-2會刺激Saccoglossus bromophenolosus的配子快速釋放[25]。

1.2.4 棘皮動物Echinoderms

RASTIGI等[26]檢測到海膽Paracentrotus lividus存在mGnRH和cGnRH-Ⅰ的免疫活性。

1.2.5 節肢動物Arthropods

1982年，HANSEN等[27]檢測到蟑螂Leucophaea maderae中存在GnRH的免疫活性。

2004年，MORGAN等[28]在羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii中用免疫組織化學的方法發現lGnRH-Ⅲ和oct-GnRH，lGnRH-Ⅲ主要分布于中腦的中型神經元，而oct-GnRH則分布于胸部神經節的大型神經元和中型神經元以及其神經纖維中。另外在卵母細胞的細胞質中還觀察到lGnRH-Ⅰ。因此，在羅氏沼蝦的體內至少存在3種GnRH形式：lGnRH-Ⅲ、oct-GnRH和lGnRH-Ⅰ，lGnRH-Ⅲ和oct-GnRH分布于腦，lGnRH-Ⅰ則存在于卵巢。這與脊椎動物一致，存在2種或2種以上的GnRH類型。

2008年，NGERNSOUNGNERN等[29]斑節對蝦Penaeus monodon中使用免疫細胞化學、免疫熒光、高效液相色譜法等方法也檢測到oct-GnRH和lGnRH-Ⅲ，它們分布于前腦和食道上神經節的中型神經元。在其中樞神經中并未檢測到lGnRH-Ⅰ、sGnRH和mGnRH。這說明斑節對蝦中的GnRH與oct-GnRH和lGnRH-Ⅲ更為相似。

2007年，李兆英[30]在中華蜜蜂Apis cerana cerana的卵子、精子以及雄蜂的蛹檢測到有GnRH受體的mRNA表達。

由上面的研究可以初步推測節肢動物中存在oct-GnRH和lGnRH-Ⅲ的類似物。

1.2.6 環節動物Annelida

研究者已在水蛭的神經組織以及蚯蚓的非神經組織中發現GnRH的免疫活性，另有學者據多毛綱Capitella sp.GnRH前體cDNA推測GnRH序列長度為15個氨基酸[13]。

1.2.7 線蟲動物Nematoda

BROWNLEE等1993年線蟲Ascaris suum在中央神經區域發現了GnRH類似物的免疫活性[9]。

1.2.8 扁形動物Platyhelminthes

ANCTIL等[31]在渦蟲Bdelloura candida神經束、上皮粘液細胞、卵黃腺以及神經分泌細胞中檢測到GnRH的免疫活性[28]。

1.2.9 刺胞動物Cnidaria

ANCTIL[32]在海腎Renilla koellikeri和海葵Nematostella vectensis中發現cGnRH-Ⅱ和mGnRH的存在，廣泛分布于內胚層及產生配子的細絲上。

2006年，TWAN等[33]檢測到石珊瑚Euphyllia ancora中GnRH的活性。

甚至還有學者在真菌酵母中發現α-接合因子，氨基酸序列為WHWLQLKPGQPMY的十三肽[34]，具有mGnRH的活性，能夠刺激哺乳動物垂體LH（Luteining hormone）和FSH(Follicle stimulating hormone)的分泌[35]。

由此可見GnRH幾乎在動物界中是普遍存在的。這說明GnRH不僅存在于原口動物和后口動物中，還存在于假體腔的線蟲動物、無體腔的扁形動物、僅有兩胚層的刺胞動物，甚至可能存在于屬于真菌的酵母中。GnRH作為一種古老的肽，且保守性較高，為其他尚未發現GnRH的物種留下了廣闊的研究空間。

2 GnRH的種類、結構與功能

2.1 GnRH的種類

在目前已經研究的GnRH中，根據其分布可分為[24]：

GnRH-Ⅰ：分布在下丘腦或間腦，刺激腦垂體釋放促性腺激素GtH，主要為mGnRH、cGnRH-Ⅰ、鯛sbGnRH等。

GnRH-Ⅱ：分布在中腦或其他腦區，起著神經遞質或調質的作用，間接參與生殖活動的調節，主要為cGnRH-Ⅱ。

GnRH-Ⅲ：分布于嗅葉和端腦，也起著神經遞質的作用，主要為鮭魚sGnRH。

GnRH-Ⅳ：既來自于下丘腦，又分布于中腦和心，主要為七鰓鰻lGnRH。

GnRH-Ⅴ：目前僅有2種且為十二肽：oct-GnRH和ap-GnRH，均來自于無脊椎動物中的軟體動物[16]。

這5種GnRH的系統進化關系如圖1所示。

2.2 無脊椎動物中GnRH的結構與功能

2.2.1 無脊椎動物中GnRH結構

在脊椎動物中，已鑒別的GnRH都是由10個氨基酸構成，包括起始的第一位的焦谷氨酸（pGlu）、第四位的絲氨酸（Ser）、第九位的脯氨酸（Pro）和第十位的甘氨酸（Gly），這4個氨基酸序列很保守。GnRH的長度及部分氨基酸序列的高度保守，表明這些保守的分子結構對其生物活性、與受體的結合以及對酶解得抵抗力方面都起著重要的作用。

而在無脊椎動物中（背囊動物GnRH為脊索動物中的無脊椎動物[20]，GnRH與脊椎動物基本一致，故排除）僅有軟體動物中的真蛸oct-GnRH、Sepia officinalis GnRH和海兔ap-GnRH的cDNA序列已經克隆，氨基酸序列得到鑒定，其前體的基本結構均包括信號肽、GnRH、斷裂位點和GnRH相關肽GAP。其中GnRH均為12個氨基酸的肽，它們的1、4、6、8、12位氨基酸與mGnRH的1、2、4、6、10位的氨基酸相同，有共同的C-末端和N-末端，可認為在mGnRH的第一和第二位氨基酸間插入2個氨基酸——天冬酰胺Asn和酪氨酸Tyr。真蛸oct-GnRH和Sepia officinalis GnRH氨基酸序列完全相同，而oct-GnRH與ap-GnRH僅在第10位和第11位的氨基酸有差別，其余的氨基酸序列則完全相同，這為研究其他軟體動物的GnRH提供了很好的啟發。mGnRH、oct-GnRH、ap-GnRH的氨基酸序列結構見表1。

圖1 脊索動物門與軟體動物門GnRH的系統進化分析圖[16]Fig.1 Phylogenetic analysis of GnRH in phylum chordata and phylum Mollusca分支上的數字為重復1 000次的自展值.

表1 oct-GnRH、ap-GnRH和mGnRH的氨基酸序列比對Tab.1 Amino acid sequences aligned among oct-GnRH，ap-GnRH and mGnRH

2.2.2 無脊椎動物中GnRH功能

在脊椎動物中，促性腺激素釋放激素(GnRH)是由的腦(主要是視前—下丘腦)產生的一類十肽激素,它對腦垂體促性腺激素(GtH)的合成分泌的神經調節中起關鍵作用[36]。GnRH通過調節血漿GtH及性類固醇的水平,能夠改變動物的性行為，是生殖生物學研究的核心內容之一。

研究表明，GnRH及其類似物在無脊椎動物中也起著刺激生殖活動的作用。如用哺乳動物的mGnRH和cGnRH-Ⅰ與被囊動物（Ciona intestinalis）的性腺進行離體孵育培養，能夠促進性腺的固醇類激素的釋放；向被囊動物注射各種類型的GnRH，能夠誘導其配子的釋放。

GOLDBERG等[11]研究了田螺Helisoma trivolvis的mGnRH和cGnRH-Ⅱ的活性，且將Helisoma trivolvis的中樞神經的提取物作用于金魚，會刺激金魚的垂體釋放促性腺激素，并且mGnRH還能促進田螺產卵量的增加。

研究還表明：GnRH在一些無脊椎動物中還起著性外激素的作用，促進需要在水中受精的生物受精。如在海水中加入低濃度的特定GnRH，能夠誘導半索動物（Sacoglossus sp.）和軟體動物（Mopalia sp.）的成熟個體產卵，將成熟的配子迅速釋放到海水中[37]。

oct-GnRH具有除生殖調控之外的其他功能，可能作為一個神經調質調節Octopus vulgaris腦的更高級活動，例如攝食、運動、記憶等，oct-GnRH可以調節食管的運動，影響口球的攝食活動，可以調節輸卵管、血管和鰓心的伸縮以及心跳的時間和力度，還可以作為神經調質，影響視覺和觸覺類似于小腦的區域[13]。

可見，GnRH在由低等無脊椎動物向高等脊椎動物進化的過程中，對動物的生殖活動的調控都起著重要的作用。

3 總結

綜上所述，GnRH在動物界中具有普遍存在性，且主要分布于動物的中樞神經以及性腺、心等非神經組織中，這為無脊椎動物的GnRH生殖調控的研究提供了參考。目前，除被囊動物外，僅有Octopus vulgaris、Sepia officinalis和Aplysia californica鑒定了GnRH的結構，因此在尚未研究的無脊椎動物中還具有廣闊的研究空間。當然隨著GnRH在無脊椎動物中的深入研究，一些新的問題也會隨之出現。

脊索動物中已確定的GnRH均由10個氨基酸構成，在其進化的過程中，不僅肽鏈的長度保持不變，而且部分氨基酸序列與也保持不變，包括起始的第一位pGlu、第四位的Ser、第九位的Pro和第十位的Gly。通過表1中無脊椎動物中的oct-GnRH、ap-GnRH和mGnRH的比對，發現oct-GnRH和ap-GnRH與脊索動物一樣也具有這些保守的氨基酸序列。這表明GnRH保守的分子結構對其生物活性、與受體的結合以及對酶解得抵抗力方面都起著重要的作用，這種選擇性的保守使不同物種中的GnRH的功能基本不變。

雖然無脊椎動物與脊索動物的GnRH存在一定的保守性，但也出現了一定的差異性。如從無脊椎動物中已鑒定出的oct-GnRH和ap-GnRH結構來看，與脊索動物的GnRH的肽鏈的長度不同，且均大于10個氨基酸序列，這可能是GnRH的基因在漫長的進化過程中出現了核苷酸序列的部分丟失所致。

還有一個問題就是如何定義GnRH？目前還沒有一個非常明確的定義。酵母中的α-接合因子雖被認為是GnRH的類似物，具有mGnRH的活性，刺激哺乳動物垂體中LH和FSH的分泌，但是其氨基酸序列為WHWLQLKPGQPMY[34]，與常規的GnRH結構沒有任何的相似性。即α-接合因子與GnRH的功能類似，結構存在明顯的差異，這也可能是α-接合因子與哺乳動物的GnRH具有相同的受體，使其具有GnRH的作用。

所有的這些問題都需要對GnRH作深入細致的研究后才有可能得以解決。

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