氟伐他汀對抗磷脂綜合征患者血清誘導的人血管內皮細胞MMP-9的影響

趙小艷,郝 斌 ,楊 濤,曹文東,皮興濤,續慧民

下肢深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis,DVT)是由手術、創傷、腫瘤等多種因素導致的血栓性疾病,其中20%不明原因深靜脈血栓形成患者合并抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)[1]。APS是由于血清抗磷脂抗體(anti-phospholipidantibody,APL)滴度升高所導致的自身免疫性疾病,其特征為反復的動靜脈血栓形成、習慣性流產、血小板減少等[2]。目前APL活化內皮致血栓形成的確切機制尚不明確,可能與NF-κ B/Rel系統有關[3]。NF-κ B是多亞單位轉錄因子,可以與核內某些基因的調控序列結合使其活化,引起細胞組織因子、黏附分子、基質金屬蛋白酶、趨化因子等表達明顯增加,內皮細胞向促凝及促炎癥的表型轉變。炎癥標志物基質金屬蛋白酶(matrix metaloproteinase-9,MMP-9)又稱明膠酶 B,通過炎癥反應促進血栓形成[4]。MM P-9濃度在APS患者血清中顯著升高[5],那么 APS患者是否通過 APL誘導MMP-9表達增高促進血栓形成是本研究的一個目的。

氟伐他汀,一種羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,除降脂外還有改善內皮功能、抗炎、減少血栓形成等保護心血管作用[6]。氟伐地汀可獨立于降脂作用降低高膽固醇血癥患者血清MMP-9表達水平[7]。那么其是否可以通過降低APL誘導的M MP-9表達抑制血栓形成,這為臨床DVT合并APS的治療提供了新思路。

1 資料與方法

1.1 細胞 人臍靜脈內皮細胞株HUVEC-12購自上海門諜塔生物科技發展有限公司。

1.2 主要試劑 TRIZOL試劑為美國Invitrogen公司產品,RPMI1640培養基為美國Gibco公司產品,TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、transtaq酶為日本 TaKaRa公司產品,PCR引物由Primer Premier5.0軟件設計,北京奧科生物技術有限責任公司合成,Western blot試劑盒為美國KPL公司產品,MM P-9ELISA試劑盒、兔抗人NF-κ Bp65多克隆抗體為武漢博士德生物有限公司產品,氟伐他汀為北京諾華公司產品,胎牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 HUVEC細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液、37℃、5%CO2飽和濕度條件下傳代培養。

1.3.2 病例收集及血清制備 收集2009年1月—2009年7月山西醫科大學第二醫院血管乳腺外科下肢DV T合并APS住院患者(均ACL＞40 U和/或抗β2GPI＞70 U 10例),同期體檢健康者10例。清晨空腹采血20 mL,留取血清保存于-70℃。

1.3.3 細胞分組 A組:空白對照組,未加任何干預因素培養基。B組:正常血清對照組,50%培養基+50%健康對照血清。C組:APS患者血清組,50%培養基+50%APS患者血清。D1組:50%APS患者血清+2.5 mol/L氟伐他汀組。D2組:50%APS患者血清+5 mol/L氟伐他汀組。D3組:50%APS患者血清+10 mol/L氟伐他汀組。E1組:50%APS患者血清+2.5 mol/L氟伐他汀+0.2 mmol/L甲羥戊酸組。E2組:50%APS患者血清+5 mol/L氟伐他汀+0.2 mmol/L甲羥戊酸組。E3組:50%APS患者血清+10 mol/L氟伐他汀+0.2 mmol/L甲羥戊酸組。

1.3.4 培養液中MMP-9濃度的檢測 雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定MMP-9濃度。

1.3.5 RT-PCR檢測MMP-9mRNA表達 Trizol試劑法提取各組細胞總RNA,采用RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis kitK1622反轉錄為cDNA。

1.3.6 Western-blot檢測NF-κ B p65蛋白表達 通過凝膠分析系統進行分析,將NF-κ B p65及β-actin的蛋白條帶灰度的比值作為 NF-κ B p65的相對表達量。

2 結 果

2.1 ELISA檢測細胞培養液中MMP-9濃度 A組和B組MMP-9濃度無統計學意義(P＞0.05)。C組 MMP-9明顯升高(P＜0.05),D1、D2、D3組MMP-9濃度較C組下降(P＜0.05)。E組與C組相比無統計學意義。詳見圖1。

圖1 各組細胞培養液M MP-9濃度比較

2.2 RT-PCR檢測各組細胞M MP-9mRNA表達 各組細胞均可以檢測到MMP-9mRNA表達,于187bp處可見一條亮帶,半定量結果顯示:C組細胞MMP-9mRNA相對表達量高于A、B組(P＜0.05),D1 、D2、D3組細胞 MMP-9mRNA 相對表達量呈濃度依賴性下降(P＜0.05),E組細胞 MMP-9 mRNA相對表達量與C組無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組MMP-9mRNA表達水平比較(±s)

表1 各組MMP-9mRNA表達水平比較(±s)

組別 n MM P-9mRNA相對表達量A組 3 0.172±0.013 B組 3 0.166±0.012 C組 3 0.628±0.0241)D1組 3 0.469±0.0161)2)D2組 3 0.348±0.0161)2)D3組 3 0.278±0.0261)2)3)E1組 3 0.621±0.0332)E2組 3 0.614±0.0312)E3組 3 0.614±0.0342)與A組比較,1)P＜0.05;與C組比較,2)P＜0.05;與D1、D2組比較,3)P＜0.05

2.3 Western-blot法檢測各組細胞NF-κ Bp65含量 A組、B組細胞NF-κ B p 6 5含量無統計學意義。C組細胞NF-κ Bp65表達明顯升高,D1、D2、D3組細胞 NF-κ Bp65表達較C組下降,并具有濃度依賴性(P＜0.05),E組細胞與C組相比無統計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 各組NF-κ Bp65總蛋白表達水平比較(±s)

表2 各組NF-κ Bp65總蛋白表達水平比較(±s)

組別 n NF-κ Bp65總蛋白表達量A組 3 1.017 2±0.002 9 B組 3 1.020 0±0.002 8 C組 3 1.165 9±0.007 71)D1組 3 1.066 0±0.004 51)2)D2組 3 1.051 2±0.009 41)2)D3組 3 1.033 6±0.009 01)2)3)E1組 3 1.158 6±0.006 92)E2組 3 1.155 6±0.008 02)E3組 3 1.155 1±0.006 72)與A組比較,1)P＜0.05;與C組比較,2)P＜0.05;與D1、D2組比較,3)P＜0.05

3 討 論

DVT合并APS的特征為難治而反復發生的血栓形成。APL在APS的病理過程中擔任著重要角色。APL通過與β2-糖蛋白-磷脂復合物結合活化內皮細胞誘導炎癥分子、細胞因子等表達,從而導致血管內血栓形成,這些作用可能與NF-κ B/Rel系統激活有關。NF-κ B是多亞單位轉錄因子,與核內某些基因的調控序列結合使其活化,引起細胞組織因子、黏附分子、基質金屬蛋白酶等表達明顯增加,內皮細胞向促凝及促炎癥的表型轉變。

MMPs是一個具有鋅結構域的內皮蛋白酶家族,不僅在正常組織的細胞外基質重塑中起關鍵作用,而且在動脈粥樣硬化,斑塊破裂,血栓形成等病理過程中也起一定作用。MMP-9為明膠酶B,其表達是一個在基因轉錄和蛋白分泌水平復雜的體系,受細胞因子、炎癥、金屬蛋白酶類組織抑制劑的調節[5],尤其與炎癥反應密切相關[4]。MM P-9濃度在自身免疫系統疾病[6]及動脈粥樣硬化、冠脈綜合征、外周血管疾病[7]患者血清中顯著升高。本研究從mRNA及蛋白水平分別檢測了人血管內皮細胞上 MMP-9及NF-κ Bp65的表達,證實APS患者血清能明顯促進人血管內皮細胞MMP-9及NF-κ Bp65的表達,表明APS患者血栓形成可能是由APL通過NF-κ B途徑上調MM P-9表達所致。另有研究表明APL活化內皮與內皮表面toll-like樣受體介導細胞信號轉導有關[8]。

氟伐他汀通過競爭抑制HMG-CoA還原酶,導致細胞內的異戊二烯類含量減少,抑制 Iκ B激酶復合體磷酸化致Iκ B的降解減少,降低NF-κ B的活性,從而起心血管保護作用[9]。動物實驗表明,氟伐他汀可減少巨噬細胞MMP-9表達水平[10]。本研究從細胞水平也證實氟伐他汀劑量依賴性抑制APL誘導的內皮細胞MM P-9及 NF-κ Bp65的表達,甲羥戊酸可抑制其作用。說明其可能通過抑制NF-κ B途徑降低APL誘導的MM P-9表達抑制血栓形成。

臨床上針對DVT合并APS的治療主要包括抗凝、溶栓等,但是由于出血傾向、費用昂貴等限制了其長期使用,使得此類患者血栓反復發作,尋找新的預防用藥,迫在眉睫。本研究提示氟伐他汀可能通過抑制血管內皮細胞MM P-9的表達干預APS誘導的血栓形成,為今后DVT合并APS的治療及預防提供了新的思路。

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