澤蘭對人冠狀動脈平滑肌細胞增殖的影響1)

聶 波,李佳彥,王碩仁,朱陵群,孫逸坤,崔 巍,牛福玲

澤蘭是一味傳統的活血化瘀中藥,為唇形科植物毛葉地瓜兒苗(Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel)的干燥地上部分,具有活血化瘀、行水消腫的功能[1]。目前,地瓜兒苗與毛葉地瓜兒苗臨床上均做澤蘭使用。以往的研究顯示:澤蘭具有抑制多種細胞增殖的作用,包括人成纖維細胞[2]、SPC-A-1人肺腺癌細胞[3]、人肝癌細胞(HepG2)和人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)[4]等。但是關于澤蘭是否具有抑制血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖的作用尚不清楚。VSMC異常增殖在動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)病變發生過程中起關鍵作用。有效地抑制VSMC增殖以阻斷動脈粥樣硬化(AS)進程具有重要的理論和臨床意義。因此,本研究以中藥澤蘭為研究對象,于體外培養的人冠狀動脈平滑肌細胞(human coronary artery smooth muscle cells,HCASMC)上,觀察澤蘭水提物和乙醇洗脫物對該細胞的增殖和細胞周期的影響,以探討澤蘭抗動脈粥樣硬化的藥理作用,為動脈粥樣硬化創新藥物開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 HCASMC(美國Cascade公司),每管含有 5×105個活細胞,系傳代培養至第三代后凍存所得。保存于液氮中。

1.2 藥物 澤蘭產于河北白洋淀,于2007年4月采集,由北京中醫藥大學鑒定為唇形科植物地瓜兒苗。用水提取,過濾,濃縮,離心除蛋白,冷凍干燥,得水提液干粉(LLST)。水提液濃縮后上AB-8大孔樹脂柱,水洗后,用95%的乙醇洗脫,收集95%乙醇洗脫液,冷凍干燥,得95%乙醇洗脫液干粉(LLCX)。

1.3 試劑 大孔樹脂AB-8(河北滄州保恩化工有限公司,藥用級);M231基礎培養基(美國Cascade公司)。平滑肌細胞生長補充劑(SMGS,美國Cascade公司。胰酶/EDTA(美國 Gibco公司);RNA酶A和M TT均購自美國Sigma公司。

1.4 儀器 FD-1D-80℃冷凍干燥機(北京博醫康);128C-400自動酶標儀(奧地利,Clinicbio);LD5-2B低速離心機(北京雷勃爾離心機公司);FACSCalibur流式細胞儀(美國 BECTON DICKINSON公司);IMT-2倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.5 細胞的復蘇與傳代培養 取出含有HCASMC的凍存管,37℃水浴解凍,混勻,稀釋成濃度為1.25×104個/mL的細胞懸液,種入75 cm2培養瓶中,每瓶加入細胞懸液15 mL,搖勻。將培養瓶置于37℃,5%CO2的培養箱中。在細胞復蘇后24 h到36 h之間換液,之后每48 h換液一次。至細胞長至80%時,以胰酶消化,傳代,進行傳代培養。

1.6 細胞增殖抑制實驗(MT T比色法)取培養第6～8代HCASMC,調整細胞密度至1×104/mL,以每孔100 μ L接種于96板,培養24 h,待細胞生長成融合狀態時,隨機分組:空白組、不同濃度澤蘭 LLST 組(320 μ g/mL、640 μ g/mL、1 280μ g/mL 、2 560μ g/mL、5 120μ g/mL)和不同濃度澤蘭 LLCX(40μ g/mL、80 μ g/mL、160 μ g/mL 、320 μ g/mL 、640 μ g/mL)。 每組 設 6 個復孔 ,繼續培養2 4 h后,每孔加入2 0μ L MT T溶液(5 mg/mL),置37℃,5%CO2培養箱中繼續培養4 h,終止培養,吸棄孔內上清液,每孔加入 150 μ L DMSO,震蕩10 min在 492 nm波長下測定各孔OD值。

1.7 流式細胞儀分析細胞周期和DNA合成 取培養第6～8代HCASMC,調整細胞密度至 1.5×105/mL,將細胞接種于 6孔板,培養24 h,觀察待細胞長成融合狀態時,隨機分組:空白組、不同濃度澤蘭LLST給藥組,繼續培養24 h后,以0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA-Na2等量混合配比的消化液消化HCASMC,制備單細胞懸液,流式細胞儀測定細胞周期變化。

1.8 統計學處理 采用SPSS 11.5統計分析軟件,均數間經方差齊性檢驗后,數據以均數±標準差(±s)表示。統計方法選用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 澤蘭LLST和LLCX對HCASMC增殖的影響

2.1.1 澤蘭LLST對HCASMC增殖的影響 在藥物作用24 h后,MT T結果顯示各藥物劑量組與空白組比較均有統計學意義(P＜0.05),顯示良好的抑制增殖的作用;當藥物濃度為320 μ g/mL,640 μ g/mL,1 280 μ g/mL 時 ,三者不能呈良好的線性關系;當藥物濃度為2 560 μ g/mL,5 120 μ g/mL時,OD值顯示兩者接近于半數致死量,顯示該藥物具有一定的毒性。詳見表1。

表1 不同濃度澤蘭L LST對HCASMC增殖的影響(±s)

表1 不同濃度澤蘭L LST對HCASMC增殖的影響(±s)

藥物劑量 n OD值空白 6 0.314±0.063 320 μ g/mL 6 0.234±0.0151)640 μ g/mL 6 0.226±0.0131)1 280 μ g/mL 6 0.248±0.0171)2 560 μ g/mL 6 0.176±0.0351)5 120 μ g/mL 6 0.128±0.0661)與空白組比較,1)P＜0.05

2.1.2 澤蘭LLCX對HCASMC增殖的影響 在藥物作用24 h后,MT T結果顯示各藥物劑量組與空白組比較均有統計學意義(P＜0.05),顯示良好的抑制增殖作用;當藥物濃度為40 μ g/mL,80 μ g/mL,160 μ g/mL 時,三 者不能呈良 好的線 性關系;當藥物濃度為 320 μ g/mL,640 μ g/mL時,OD 值顯示兩者接近于半數致死量,顯示該藥物具有一定的毒性。詳見表2。

表2 不同濃度澤蘭LLCX對 HCASMC增殖的影響(±s)

表2 不同濃度澤蘭LLCX對 HCASMC增殖的影響(±s)

藥物劑量 n OD值空白 6 0.294±0.028 40 μ g/mL 6 0.200±0.0221)80 μ g/mL 6 0.190±0.0121)160 μ g/mL 6 0.215±0.0521)320 μ g/mL 6 0.179±0.0341)640 μ g/mL 6 0.143±0.0301)與空白組比較,1)P＜0.05

2.2 澤蘭LLST和LLCX對HCASMC細胞形態學的影響與空白組相比,隨著澤蘭LLST和LLCX濃度的增加,細胞數目逐漸變少,當濃度達到1 280 μ g/mL和 160 μ g/mL時,部分細胞由星形的絲狀細胞變為方形或三角形的細胞,當濃度達到2 560 μ g/mL和320μ g/mL時,死細胞數目增加;濃度達到 5 120 μ g/mL和5 640 μ g/mL時,死細胞明顯增加,細胞嚴重變形。

2.3 澤蘭LLST和LLCX對HCASM細胞周期的影響

2.3.1 澤蘭LLST對HCASM細胞周期的影響(見表3)

表3 不同濃度澤蘭水提物(LLST)對HCASM細胞周期的影響(±s)%

表3 不同濃度澤蘭水提物(LLST)對HCASM細胞周期的影響(±s)%

藥物劑量 n G0/G1 S G2/M apoptosis空白 3 71.12±1.88 20.37±2.12 8.51±1.02 0.62±0.42 320 μ g/mL 3 73.03±1.46 16.95±1.601) 10.12±0.36 0.60±0.47 640 μ g/mL 3 76.81±1.43 14.33±1.331) 9.06±0.19 1.32±1.55 1 280 μ g/mL 3 82.60±1.061) 8.51±0.441) 8.89±1.08 0.83±0.69 2 560 μ g/mL 3 72.30±3.08 15.40±1.561) 12.30±2.29 1.33±0.81 5 120 μ g/mL 3 54.96±5.571) 31.20±2.881) 13.84±3.091) 21.48±1.751)與空白組比較,1)P＜0.05

2.3.2 澤蘭LLCX對HCASM細胞周期的影響(見表4)

表4 不同濃度澤蘭醇洗物(LLCX)對HCASM細胞的影響(±s)%

表4 不同濃度澤蘭醇洗物(LLCX)對HCASM細胞的影響(±s)%

藥物劑量 n G0/G1 S G2/M apoptosis空白 3 71.88±0.48 19.70±1.81 8.42±1.35 0.57±0.49 40 μ g/mL 3 72.48±0.89 18.05±0.84 9.47±0.92 0.60±0.13 80 μ g/mL 3 78.20±2.101) 13.34±1.591) 8.46±0.54 0.39±0.35 160 μ g/mL 3 85.75±1.481) 7.40±2.581) 6.86±1.11 0.47±0.29 320 μ g/mL 3 78.26±2.161) 12.78±1.921) 8.96±0.62 0.48±0.31 640 μ g/mL 3 55.48±4.081) 28.63±1.711) 14.89±3.881) 32.48±4.901)與空白組比較,1)P＜0.05

3 討 論

動脈損傷后VSMC的異常增殖是動脈粥樣硬化等血管增殖性疾病發生的重要因素[5]。其表型轉化是VSMC增殖和遷移的關鍵性起始步驟,主要表現為從收縮型轉變為合成型,獲得增殖、遷移和合成、分泌大量細胞外基質的能力。細胞外基質的變化可直接或間接影響VSMC的增殖、黏附及遷移過程[6]。本實驗所用細胞采自正常HCASMC,其培養基有兩種:一種是維持其處于收縮態的培養基;另一種是促進其由收縮型向合成型轉變的培養基。本實驗選用第二種培養基,該培養基中添加了重組人堿性成纖維生長因子(hbFGF)和重組人表皮生長因子(hEGF)生長因子,這些因子是使HCASMC由收縮型向合成型轉變,其中 bFGF對VSMC有強烈的有絲分裂作用,可促進VSMC增殖和遷移作用[7]。因此,本實驗中的HCASMC在生長因子的作用下處于增殖狀態。

本實驗M TT結果顯示澤蘭LLST的32 0μ g/mL、6 40 μ g/mL、1 280μ g/mL 濃度組和 LLCX 的 40 μ g/mL、80μ g/mL 、160 μ g/mL濃度組在作用 24 h以后,均能抑制細胞的增殖,該系列濃度均為安全濃度,但是未呈現一定的量效關系。本研究細胞周期結果顯示,隨著濃度的增加,停留于G0/G1期細胞比例逐漸增加,而處于S期的細胞比例逐漸減少,表明其抑制增殖作用逐漸增強,但對G2/M期的調控作用均不明顯。

流式細胞結果顯示:澤蘭LLST和LLCX抑制增殖作用的最佳藥物濃度分別為 1 280 μ g/mL 和 160 μ g/mL,此時,兩者鏡下觀察可見細胞數目變少,部分細胞由星形的絲狀細胞變為方形或三角形的細胞,提示平滑肌細胞由合成型逐漸轉變成為收縮型,兩者折合生藥的量分別為8166.4μ g/mL和9 644.8μ g/mL,說明澤蘭具有抑制HCASMC增殖的活性。

本實驗觀察到澤蘭兩種干粉的兩個接近半數致死量的濃度組的MT T結果與流式細胞術結果有較好的對應性。其中最高濃度組(澤蘭水提液5 120 μ g/mL濃度組和95%乙醇洗脫液640 μ g/mL濃度組)凋亡明顯,鏡下觀察細胞大量死亡,存活細胞變形縮小,提示此藥物濃度已具有較強的毒性作用。澤蘭水提液2 560 μ g/mL濃度組及95%乙醇洗脫液 320 μ g/mL濃度組,雖然未見凋亡,但是與最高濃度具有的相似周期轉化趨勢,鏡下觀察,細胞部分死亡或變形,細胞數目變少,提示此時已有一定的毒性作用。

現代藥理學研究表明:澤蘭具有降血脂[8]、抗血小板聚集和抗血栓形成[9]等藥理作用。新近的研究顯示:澤蘭能抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的炎癥反應[10],這些環節都與動脈粥樣硬化發生發展密切相關。以往的研究顯示,澤蘭具有抑制多種細胞增殖的作用。本實驗初步得出澤蘭具有在體外抑制人堿性成纖維生長因子、人表皮生長因子刺激人冠狀動脈平滑肌細胞增殖的活性,為澤蘭深入研究抗AS活性和機制以及開發創新藥物提供基礎實驗依據。但澤蘭抑制細胞增殖的具體作用機制尚不明確,有待于進一步研究。

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