益氣活血中藥對血管生成PI3K和MAPK信號途徑的影響1)

王培利,雷 燕,王承龍

近來研究發現磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)與血管平滑肌細胞的增殖密切相關[1,2],并且PI3K信號途徑在介導人肺血管平滑肌細胞的增殖和遷移中起重要作用[3]。低氧可以激活腫瘤細胞中的PI3K途徑而調節細胞的增殖與凋亡[4]。但在缺血心肌中PI3K表達如何還未見報道。Akt又稱蛋白激酶B(proteinkinase B,PKB),是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Akt是細胞生存的關鍵因子。多種生長因子主要通過PI3K/Akt信號轉導通路而發揮作用。激活后的Akt主要通過對含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物磷酸化而發揮廣泛的生物學效應,包括抗凋亡、促細胞生存和增殖功能。同時,PI3K活化后可以直接調節促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)途徑,其中包括ERK途徑和JNK途徑。當歸補血湯具有促進缺血心肌大鼠血管生成作用[5,6]。本實驗探討了當歸補血湯對心肌缺血后PI 3K、Akt/PKB、MAPK信號轉導途徑的影響,以期明確當歸補血湯促進血管新生的信號轉導機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Folin酚(北京鼎國生物技術公司產品),丙烯酰胺、甘氨酸(Promega),硝酸四氮唑藍(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP),硝酸纖維素膜(Gelman公司)。蛋白質電泳用第二抗體:堿性磷酸酶標記的羊抗兔抗體(北京中杉金橋公司)。T ris base、十二烷基硫酸鈉,過硫酸銨,溴酚藍,胰蛋白酶,乙二胺四乙酸,1 mM苯甲基磺酰氟,0.1%抑蛋白酶肽(Sigma)。PI3K及Akt單克隆抗體試劑盒購自北京宣武醫院多肽實驗室。p38絲裂素活化蛋白激酶活性測定試劑盒(Cell Signaling)。血管內皮生長因子(VEGF),購自武漢博士德生物工程有限公司;

1.2 主要儀器 紫外/可見光光度儀Lamda-Bio(美國PE公司),電動勻漿器 DIAX900(德國Heidolph公司),轉移電泳儀DYY-Ⅲ(北京六一儀器廠),穩壓穩流電泳儀 DYY-Ⅲ(北京醫療設備廠),低溫離心機Microfuge R(BECKMAN),萬向脫色搖床TS-920(北京新技術應用研究所)。Image Pro Plus 4.0圖像分析系統,OLYMPUS生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠(中國醫學科學院實驗動物研究所,許可證:SCX京2000-0006),體重180 g～220 g。

1.3.2 實驗藥物 當歸補血湯中黃芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bunge、當歸 Angelica sinensis(Oliv)Diels,均系干品,由中國中醫研究院中藥所鑒定為正品。黃芪、當歸按5∶1比例合煎,并濃縮至含生藥1 g/mL,4℃保存備用,大、中、小劑量分別為1.2 g/100(g?d)、0.6 g/100(g? d)、0.3 g/100(g?d)。倍他樂克:阿斯利康制藥有限公司,批準文號:國藥準字H32025390,批號200311002,每只大鼠給藥2.5mg/100(g?d)。

1.3.3 心肌梗死大鼠的制備 采用冠脈結扎法,術后腹腔內注射青霉素鈉8×105U/d,連續3 d抗感染。造模成功大鼠隨機分成正常組、模型組、倍他樂克組、當歸補血湯大劑量組、當歸補血湯中劑量組、當歸補血湯小劑量組。用藥組灌服當歸補血湯煎劑和倍它樂克水溶液,其他組灌服生理鹽水,均為2周。

1.3.4 免疫組化技術測定左室梗死邊緣區VEGF表達量 心肌組織切片經脫蠟至水 ,3%H2O2滅活內源性過氧化酶 ,枸櫞酸緩沖液熱修復,0.01M PBS緩沖液洗滌 ,山羊血清封閉液封閉,一抗孵育4℃過夜,0.01M PBS緩沖液洗滌,二抗孵育,0.01M PBS緩沖液洗滌,SABC試劑孵育,光學顯微鏡下觀察心肌微血管特異性顯色。采用Image Pro Plus 4.0圖像分析軟件采集數據,計算陽性區域所占總面積。

1.3.5 蛋白定量 兩周后麻醉取材。切下梗死邊緣區;將其置于eppendorf管中加入預冷的 0.01M PBS液洗滌2次;按照1∶5加入預冷組織裂解液,Folin酚法定量蛋白;分裝上清,于-70℃保存。

1.3.6 Western免疫印跡方法 應用微量加樣器加入25 μ L樣品,第一抗,置于搖床上搖動,室溫下 2 h。傾去一抗,PBS洗膜3次,每次10 min。加入1∶2 000堿性磷酸酶標記的羊抗鼠,置于搖床上,室溫下 2 h。棄去二抗,PBS洗膜3次,每次10 min。加入顯色緩沖液,室溫下染色,觀察到有藍色條帶出現后,用蒸餾水沖洗終止反應。

1.4 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件包進行統計。采用方差分析。

2 結 果

2.1 當歸補血湯對左室梗死邊緣區VEGF表達量的影響 模型組的左室梗死邊緣區VEGF陽性面積明顯高于對照組(P＜0.05),其他各治療組也有不同程度的升高,而且較模型組更高。其中倍他樂克組和當歸補血湯小劑量組最為顯著(P＜0.05)。詳見圖1。

表1 當歸補血湯對左室梗死邊緣區VEGF表達量和Ⅷ因子血管密度的影響

2.2 PI3K蛋白的表達 除對照組未見表達外,其余各組均有不同程度的PI3K蛋白的表達,其中倍他樂克組和當歸補血湯中劑量組表達最為明顯,而模型組和當歸補血湯大劑量組以及小劑量組表達較少,條帶灰度最弱。說明本缺氧模型具有較弱促進PI3K表達的作用,而倍他樂克和中藥則可能促進PI3K的表達。詳見圖1、圖2。

2.3 Akt蛋白的表達 各組均有不同程度的Akt蛋白表達,其中對照組最少。模型組也有適量的表達,倍他樂克組和當歸補血湯中劑量組較為明顯。缺氧誘導通過Akt途徑,而藥物也可能通過該途徑發揮作用。詳見圖3、圖4。

圖3 各組AKT蛋白表達條帶

圖4 Akt Western印跡信號強度灰度分析

2.4 p38 MAPK蛋白的表達 各組均有不同程度的p38 M APK蛋白表達,當歸補血湯大劑量組、衰老組以及倍他樂克組表達較少。心梗應激因素可激活MAPK信號轉導途徑,當歸補血湯的作用有劑量差別,隨著劑量增加,激活p38M APK蛋白表達的作用有所減弱。詳見圖 5、圖6。

3 討 論

血管生成和信號轉導機制同為當前兩大熱點研究領域。近年來在促血管生成的介導因子及其在血管內皮細胞中的信號轉導機制等方面的研究取得了重要進展。

目前,血管生成研究主要涉及腫瘤和心血管兩個學科領域,尤其在腫瘤方面,研究非常深入。腫瘤血管生成致病機制較為成熟,對信號轉導機制研究也較為清晰,其中MAPK家族被認為是血管生成信號通路的重要成員,具有調節細胞生長與分化等不同的功能。而在心血管疾病尤其心肌缺血方面的信號轉導機制卻鮮有研究,尤其益氣活血中藥改善缺血心肌功能、促進血管新生的信號轉導機制更少有報道。

M APK家族主要分為三個亞類:ERKl/2、JNK以及p38MAPK。ERKl/2信號通路被生長因子活化[7];而JNK通路和p38/HOG-1通路,是由紫外線、滲透壓變化、細胞因子(IL-1)、TNF和生理應激而激活[8],統稱MAPK應激信號通路。以前大量的研究證實 VEGF、FGF、PDGF、EGF等細胞因子主要通過絲裂原活化的蛋白激酶信號途徑介導細胞增殖。但越來越多的研究發現,低氧誘導產生的許多生長因子可通過PI3K途徑介導血管平滑肌細胞(VSMC)增殖,并且MAPK可作為PI3K下游的靶分子,通過PI3K/MAPK途徑調節細胞增殖。

PI3K是許多生命活動中關鍵的信號分子,PI3K介導的信號轉導通路調節細胞的分裂、分化、凋亡等活動[9,10]。當生長因子與細胞膜受體結合后激活PI3K,磷酸化細胞膜上肌醇環中第3位輕基產生3-PIP、3,4-PIP2和3,4,5-PIP3,這些產物可作為第二信使作用于其下游的N與細胞生長密切相關的蛋白或激酶,如Akt,最終活化和上調cyclinD1引起細胞增殖[11,12]。

Akt參與由生長因子激活的經P13K介導的信號轉導過程日益受到關注。PKB的表達可以在缺血區域誘導產生新生血管,近來也表明其能夠維持受損心肌組織的完整性,介導信號轉導途徑[13,14]。

Akt是PI3K下游直接的靶蛋白。PDGF等多種生長因子都能通過PDGF受體上酪氨酸(Y740/Y751)位點磷酸化后產生與PI3K的p85亞基結合的高親和位點,誘導PKB的激活。此外,由于PI3K的p110亞基也可直接與小分子GTP酶Ras相互作用,活化的Ras也可通過 PI3K部分激活 PKB。PKB還可通過細胞核內信號轉導通路直接作用于核轉錄因子CREB,引起特定基因的表達。PI3K激活的PKB可以介導多種生長因子如PDGF、EGF、胰島素、凝血酶 dGF-1及NGF等所誘發的細胞生長[15]。

本實驗結果表明,益氣活血中藥當歸補血湯能夠促進缺血區域VEGF的表達;同時不同程度促進PI3K的表達,較模型組與倍他樂克組具有明顯優勢。通過對PI3K的促表達作用,從而進一步啟動了下游信號途徑的激活。倍它樂克組和當歸補血湯中劑量組較為明顯促進Akt蛋白的表達,模型組、當歸補血湯小劑量組卻明顯激活MAPK蛋白表達。通過以上途徑,最終使得缺血區域心肌的VEGF蛋白表達增強,產生缺血區域血管生成作用。這表明益氣活血中藥從不同途徑進行了抗缺血缺氧及促血管生成的作用。

同時缺血缺氧也是一個重要的信號啟動機制,實驗中顯示其作用較為明顯。已經證實益氣活血藥物具有提高人體免疫力,增強自我修復能力的作用。本課題組前期研究也表明,益氣活血中藥當歸補血湯能夠改善心肌缺血,促進血管生成。在缺血缺氧的刺激下,心肌細胞、血管內皮細胞遭受到了破壞,機體啟動保護機制,通過促進細胞增加、血管增加來改善損害,但局部而應急的反應不能挽救大面積的損傷。益氣活血藥物通過調節細胞信號轉導機制,啟動生長、增殖信號,促進新生血管生成,增強了機體抗修復能力,可望配合應對超過自我修復能力的損傷。新的血管生成因子及其信號轉導機制的研究不僅是發育生物學和細胞生物學的基礎課題,更具有重要的臨床意義,可以說人類多數疾病都與血液循環和新血管生成有關。然而,血管生成的促進和抑制,是否會影響腫瘤的消長,同時又是否影響缺血心肌側支的成熟,這仍是研究的難點。雖然這些研究還比較淺顯,但進展很快,必將為多種疾病的有效治療提供一些新的思路。

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