三七總皂苷對缺氧再給氧血管內皮細胞NF-κ B及ICAM-1表達的影響1)

江小萍,李海全,潘少霞,方永奇,劉桂娥,歐陽永紅,沈祖泓

隨著溶栓、冠狀動脈腔內成形術及冠脈搭橋術等再灌注治療在臨床的廣泛開展,心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)越來越受到臨床的重視,減輕或避免MIRI的發生是溶栓、冠狀動脈腔內成形術及冠脈搭橋術成功的關鍵,也是目前冠心病治療領域的熱點問題之一。三七總皂甙(total panax notoginseng saponins,tPNS)是我國中藥田三七的主要藥用成分,具有對抗心肌缺血-再灌注損傷、鈣拮抗、心肌保護等[1]作用,但其分子機制并不完全明確。本研究以人臍靜脈內皮細胞株(ECV304)為研究對象,模擬心肌缺血再灌注環境,通過檢測血管內皮細胞缺氧再給氧損傷(hypoxia/reoxygenation,H/R)后超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)和核轉錄因子(nuclear factor kappa-B,NF-κ B)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達及 tPNS干預后SOD、GSH、MDA 和NF-κ B、ICAM-1表達的變化,從血管內皮細胞損傷的角度探討M IRI和tPNS保護作用的機制,為MIRI提供中醫藥治療的方法。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養液 ECV304細胞株(中山大學細胞庫);RPMI-1640培養基(美國GIBCO);胎牛血清(美國GIBCO)。

1.2 主要試劑與儀器 SOD、MDA及GSH測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),單克隆抗體 CD54-PE、IgG-PE(美國PharMingen),flour-3/AM(美國 Biotium),流式細胞儀(美國BECKM AN COULTER公司ALTRA型),四色熒光,配套EXPO32采集分析軟件,MultiCycle分析軟件。

1.3 細胞培養及分組 將培養的ECV304細胞分為7組,正常組:未予H/R及藥物干預處理;模型組:予 H/R處理;三七總皂苷高劑量組:3.125 1 mg/L;三七總皂苷中劑量組:1.563 1 mg/L;三七總皂苷低劑量組:0.781mg/L;吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)組:PDTC 100 μ mol/L;維拉帕米組:100 μ mol/L維拉帕米;除正常組、模型組外其余5組分別與藥物共同孵育1 h后制作H/R模型。

1.4 H/R模型的制作 將生長至穩定狀態的ECV304細胞置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養箱正常培養 1 h,放入 37℃、5%CO2、95%N2的培養箱培養1.5 h,取出置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養箱正常培養2 h[2],用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA-Na2混合液消化收集各組細胞。

1.5 氧自由基清除功能測定 收集各組細胞培養上清液,按試劑盒操作步驟測定SOD、MDA和GSH。

1.6 內皮細胞 NF-κ B P65表達 各組 PCAEC爬片,每組 8個樣本,4%多聚甲醛固定,一抗為NF-κ B P65兔多克隆IgG抗體,稀釋比例為1∶200;余步驟按試劑盒操作步驟進行。胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞,每個樣本任選6個視野進行陽性細胞計數,陽性率用陽性細胞數占同一視野ECV304細胞數的百分比表示。每個樣本的陽性率取不同視野陽性率的平均值。

1.7 內皮細胞ICAM-1的表達 收集的單個細胞,PBS洗兩次,離心去上清,加入CD54-PE單克隆抗體各 10 μ L,室溫孵育30 min后,PBS重懸細胞,流式細胞儀檢測,其結果以陽性百分率表示。每份樣本均設陰性對照(加相應IgG抗體),以消除本底熒光的影響。

1.8 統計學處理 SPSS 11.5統計分析軟件對數據進行處理,數據以均數±標準差(±s)表示,兩組比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 SOD活性、MDA及GSH的含量(見表1)正常組細胞氧自由基清除功能無明顯改變;模型組,tPNS高、中、低濃度組,維拉帕米組及PDTC組細胞SOD活性、GSH含量明顯低于正常組;MDA的含量明顯高于正常組。tPNS高、中、低濃度組細胞SOD活性、GSH含量明顯高于H/R組同期,MDA含量明顯低于H/R組,且呈濃度依賴性改變,tPNS高濃度組細胞SOD活性、GSH含量明顯高于維拉帕米組及PDTC組,MDA的含量明顯低于維拉帕米組及PDTC組。

2.2 NF-κ B、ICAM-1表達的變化(見表1)正常組細胞NF-κ B及 ICAM-1表達無明顯改變;模型組、tPNS高、中、低濃度組、維拉帕米組及PDTC組細胞NF-κ B及ICAM-1表達明顯高于正常組,其中 tPNS高、中、低濃度組細胞NF-κ B及ICAM-1表達明顯低于H/R組,且呈濃度依賴性改變;tPNS高濃度組細胞NF-κ B及ICAM-1表達明顯低于維拉帕米組及PDTC組。

表1 各組ECV304 NF-κ B、ICAM-1表達,SOD、MDA、GSH含量比較(±s)

表1 各組ECV304 NF-κ B、ICAM-1表達,SOD、MDA、GSH含量比較(±s)

組別 SOD(U/mL)MDA(nmol/mL)GSH(mg/L)NF-κ B ICAM-1(%)正常組 11.89±1.58 0.13±0.08 97.73±10.69 3.47±0.92 4.33±0.91 tPNS高劑量組 10.33±2.461) 3.38±0.481) 84.92±8.211) 23.93±7.411) 28.14±2.781)tPNS中劑量組 9.72±1.991) 3.50±0.321) 79.23±8.531) 29.59±5.621) 34.25±4.381)tPNS低劑量組 8.34±1.931) 3.49±0.361) 72.10±6.601) 32.56±3.881) 39.05±4.101)模型組 6.86±3.021) 6.69±0.791) 58.53±4.971) 54.80±5.151) 80.01±2.641)維拉帕米組 9.24±1.791) 3.29±0.531) 79.38±8.641) 24.39±6.471) 34.98±5.001)PDTC組 9.88±2.121) 3.42±0.361) 79.50±9.011) 25.92±5.161) 36.84±4.341)與正常組比較,1)P＜0.05

3 討 論

血管內皮細胞不僅是血液與血管壁之間的屏障,更是重要的內分泌器官和效應器官,通過釋放和合成多種血管活性因子,在血管自穩態的調節中發揮著重要作用。在心肌缺血再灌注過程中,由于大量氧自由基的產生,血管內皮細胞被激活,激活的內皮細胞能表達多種細胞黏附分子,它引起的急性炎癥反應影響內皮和心肌細胞的結構、功能和代謝[3]。NF-κ B是一系列前炎癥基因激活的共同途徑,對心肌再灌注損傷的發生起著重要的作用[4]。直接或間接抑制NF-κ B活化均可減輕缺血再灌注損傷[5,6]。

傳統中藥三七主要藥用成分為tPNS,具有散癖止血,消腫定痛功效。歷代醫家對其藥用價值都給予了高度評價。目前認為tPNS對抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制主要是:抗氧自由基損傷;抗脂質過氧化;抑制鈣通道防止鈣超載;提高心肌SOD活性;增加心肌營養血流量等[7]。三七總皂苷能否減輕缺氧復氧血管內皮細胞的損傷并不完全清楚。本研究采用ECV304作為研究對象,結果表明在缺氧-再給氧時,血管內皮細胞被激活,細胞氧自由基清除功能明顯降低,NF-κ B及ICAM-1的表達升高,用三七總皂苷預處理后,細胞氧自由基清除功能明顯改善,NF-κ B的活性明顯被抑制,同時伴有ICAM-1表達的下降,且呈濃度依賴性,提示tPNS可有效地抑制 NF-κ B、ICAM-1表達,明顯改善細胞氧自由基清除功能,減輕缺氧再給氧引起的細胞損傷。此結果為進一步探討缺血再灌注損傷對心功能造成損害的作用機制,尋求中醫藥治療缺血再灌注損傷的新途徑奠定了基礎。

[1]徐輝.三七總皂苷對心血管系統的影響及作用機制[J].現代中西醫結合雜志,2006,15(19):2720-2722.

[2]Kim CD,Kim YK,Lee SH,et al.Rebamipide inhibits neutrophil adhesion to hypoxia/reoxygenation-stimulated endothelial cells via nuclear factor-kappaB-dependent pathway[J].J Pharmacol ExpTher,2000,294(3):864-869.

[3]F rangogiannis NG,Smith CW,Entman M L.T he inflammatory response in myocardial infarction[J].Cardiovasc Res,2002,53:31-47.

[4]Yeh CH,Lin YM,Wu YC,et al.Inhibition of NF-kappa B activation can attenuate ischemia/reperfusion-induced contractility impairment via decreasing cardiomyocytic proinflammatory gene upregulation and matrix metalloproteinase expression[J].J Cardiovasc Pharmacol,2005,45(4):301-309.

[5]Feeley BT,Miniati DN,Park AK,et al.Nuclear factor-kappaB transcription factor decoy treatment inhibits graft coronary artery disease after cardiac transplantation in rodents[J].Transplantation,2000,70(11):1560-8.

[6]張曉文,饒曼人.參三七皂戒Rg1預適應對肥厚乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷的保護[J].中國臨床康復,2003,7(12):1750-1752.

[7]唐旭東,姜建青,姜大春,等.三七總皂苷對心肌缺血-再灌注中中性粒細胞核因子-κ B活化及其粘附的影響[J].中國藥理學通報,2002,18(5):556-560.