心肌細胞系H9c2缺氧上清誘導人臍靜脈內皮細胞ICAM-2的表達

婁利霞,王碩仁,張冬梅,高永紅,孫逸坤

心肌供血不足能夠造成心肌損傷,產生心肌細胞功能障礙,甚至壞死。心肌缺血時心肌細胞發生代謝的改變,以及心肌細胞內離子平衡紊亂等。缺血心肌還會發生功能和結構的變化。近來研究發現內皮細胞的變化及其炎癥反應參與了心肌缺血時損傷或適應性的改變,如缺血后微循環障礙、血管新生的發生等[1]。但是現在內皮炎癥反應的機制不清楚。炎癥反應是慢性心肌缺血的病理損傷的重要機制,可以刺激免疫細胞,調節神經體液因素參與缺血性損傷[2]。

前期的基因芯片研究工作提示,炎癥因子細胞間黏附分子-2(ICAM-2)在缺血心肌細胞與內皮細胞間相互作用研究中被證實表達上調。因此,本實驗研究缺氧培養的心肌細胞培養上清對人臍靜脈內皮細胞ICAM-2表達的影響及其分子機制,闡明缺氧心肌細胞和內皮細胞間的分子調控,有利于從旁分泌角度認識心肌缺氧條件下內皮細胞因子的表達調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞系H9c2由北京大學分子醫學研究所贈,人原代臍靜脈內皮細胞株(HUVEC,貨號C-003-5C)及其培養基M200(貨號M-200-500)、低血清生長添加劑LSGS(貨號S-003-10)購自美國Cascade Biologics公司。DM EM、胎牛血清以及胰蛋白酶購自美國Gibeco公司。

細胞因子 PDGF-AA、AB、BB,腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素(IL)-1β,IL-6,VEGF,FGF-2購自美國Peprotech公司(NewJersey,USA)。引物由北京奧科生物技術有限公司合成:ICAM-2上游引物:5'-CCGTGGCAA TGAGACTCTGCACTA-3',ICAM-2下游引物:5'-ATGGTTGCTATGGCCGGAAGG-3',GAPDH上游引物:5'-CATCTCTGCCCCCTCTGCTG-3',GAPDH下游引物:5'-CGACGCCTGCTTCACCACCT-3'。oligo(dT)15和M-MuLV反轉錄酶購自美國Promega公司(MO,USA),Taq DNA聚合酶購自大連寶生物。ICAM-2小鼠單克隆抗體(sc-9987)多克隆兔抗β-actin抗體(sc-1616)購自美國 Santa Cruz公司(CA,USA)。大鼠PDGF-ABELISA試劑盒(EK0485)購自武漢博士德生物工程有限公司,大鼠PDGF-BB ELISA試劑盒(3R123c)購自美國 RapidBio Lab公司(CA,USA)。

1.2 細胞培養 大鼠心肌細胞系H9c2在含有10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 μ g/mL四環素的 DMEM培養基中培養。HUVEC在含有100 U/mL青霉素,100 μ g/mL四環素以及LSGS添加劑的專用培養基M200中培養。HUVEC長到90%～95%時,轉入無血清和添加劑的培養基中過夜培養,然后進行實驗。

1.3 缺氧培養上清的制備 H9c2細胞37℃,5%CO2培養,長至80%～90%時去上清,PBS洗3次,加入無血清無抗生素的DMEM培養基,放入氧氣濃度為1%的缺氧培養箱(Mini Galaxy A-500,UK)。缺氧培養24 h后收集上清,用于HUVEC培養。

1.4 細胞因子刺激實驗 取4代或5代的 HUVEC細胞,長至90%后更換無因子添加劑的M200中過夜培養。參考文獻[3]制備,各細胞因子的刺激濃度為:PDGF-AA 20 ng/mL,PDGFAB 20 ng/mL,PDGF-BB 20 ng/mL,TNF-α20 ng/mL,IL-1β 5 ng/mL,IL-6 20 ng/mL,VEGF 20 ng/mL,FGF-2 25 ng/mL。

1.5 RNA提取和RT-PCR 加氯仿室溫震蕩3min,4℃12 000 r/min離心15 min,取上清加異丙醇冰上放置5 min后4℃12 000 r/min離心10 min,棄上清加75%乙醇洗沉淀,4℃12 000 r/min離心10 min后棄上清,室溫晾干,加入DEPC處理過的H2O冰上溶解,紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。

取1 μ g總 RNA,在 oligo(dT)15和M-MuLV 反轉錄酶作用下反轉錄為cDNA。PCR反應體系為25μL∶1μ L cDNA,5 μ mol/L上下游引物各1μL,2.5 mmol/L dNTP混合物 1μ L,1.5 mmol/L MgCl21.5 μ L,10×PCR 緩沖液 2.5 μ L,1.25 U Taq DNA聚合酶。反應條件為:94℃變性5 min,然后進行30次擴增反應:94℃30 s,57℃30 s,72℃延伸 40 s,最后72℃延伸10 min。

1.6 Western Blot檢測蛋白表達 處理后細胞甩掉上清,PBS洗3次,最后吸干所有液體,加裂解緩沖液,冰浴條件下吹打裂解細胞,或行超聲破碎,4℃ 13 000 r/min離心10 min,取上清進行蛋白定量,等體積加入2x蛋白上樣緩沖液,100℃煮沸20 min。將樣本蛋白行SDS-PAGE(10%)電泳,電轉移于硝酸纖維素(NC)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,以含0.05%吐溫的PBS(TBS)洗滌 3次,1∶1 000的 ICAM-2抗體,4℃孵育過夜,TBS沖洗3遍,加入辣根過氧化酶標的羊抗兔IgG抗體(1∶6 000)。室溫孵育1h,以TBS液沖洗3次,ECL(北京Applygen公司)化學發光法顯影。

1.7 細胞培養上清細胞因子的測定 每孔加入100μ L樣品和標準品,37℃反應90 min,甩去酶標板內液體,不洗。每孔加100 μ L生物素標記的抗體,37℃反應60 min。0.01 mol/L PBS洗滌3次。每孔加100 μ L親和素-過氧化物酶復合物(ABC)工作液,37℃反應30 min。0.01 mol/L PBS洗滌5次。每孔加入90 μ L TMB顯色液,37℃避光反應6 min～10 min。每孔加入100 μ L TMB終止液,用酶標儀在450 nm測定OD值。

2 結 果

2.1 心肌細胞系缺氧培養上清誘導HUVEC的ICAM-2表達 通過H9c2心肌細胞系缺氧培養,得到心肌細胞系缺氧培養上清。在37℃,5%CO2條件下對HUVEC孵育,不同時間點收集細胞檢測發現:在mRNA水平,缺氧上清孵育1 h后ICAM-2的表達明顯升高,孵育 3 h后達到最高,在 6 h、12 h有所下降(見圖1)。通過Western Blot檢測發現,缺氧培養上清孵育后,在蛋白水平,HUVEC表達 ICAM-2在 3 h、6 h表達明顯增高,而在15 h、21 h表達有所下降,趨于正常對照(見圖2)。

2.2 細胞因子在H9c2缺氧培養上清誘導的ICAM-2表達中的作用 為了尋找是H9c2缺氧培養上清中含有的哪種細胞因子刺激了HUVEC細胞ICAM-2的表達,選擇了多種已知的細胞因子進行了細胞因子刺激實驗。在37℃,5%CO2條件下對 HUVEC刺激6 h后,收集細胞進行Western Blot檢測發現,細胞因子 PDGF-BB和 PDGF-AB可以使 HUVEC表達ICAM-2顯著增加(見圖 3)。因此推測,可能PDGF-BB和PDGF-AB是H9c2缺氧培養上清中能刺激ICAM-2表達的有效成分。為進一步驗證事實,我們對H9c2缺氧培養上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量進行了檢測,并與H9c2常氧培養上清相比較。

圖3 HUVEC細胞在不同細胞因子刺激6 h后ICAM-2的蛋白表達

2.3 H9c2的缺氧培養上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量(見表1)ELISA方法檢測H9c2的缺氧培養上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量,結果發現與常氧上清中的含量相比,在缺氧上清中PDGF-BB有顯著性增加(P＜0.05),而缺氧上清中的PDGF-AB卻有顯著減少(P＜0.01)。在缺氧培養時PDGF-BB的分泌為(64.1±7.6)pg/104細胞,較常氧培養時PDGF-BB的分泌量(55.7±4.7 pg/104)細胞增加15%。這個結果表明,缺氧條件下PDGF-BB的分泌量的增加,可能是缺氧上清誘導HUVEC細胞表達ICAM-2的原因。

表1 H9c2的常氧培養上清和缺氧培養上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量(±s)pg/104細胞

表1 H9c2的常氧培養上清和缺氧培養上清中PDGF-BB和PDGF-AB的含量(±s)pg/104細胞

項目 n 常氧 缺氧PDGF-BB 6 55.7±4.7 64.1±7.61)PDGF-AB 6 66.9±10.3 46.9±7.72)與常氧上清比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

3 討 論

心肌細胞的缺氧可以導致心肌細胞損傷甚至凋亡,是冠心病、心肌梗死發生的重要病理環節。缺氧發生后,常會在缺血組織發生炎癥反應以及小血管數目的增加。其中的機制涉及心肌細胞與內皮細胞間的相互作用。但是迄今為止,它們之間的相互作用還不是很清楚。

本研究發現,心肌細胞系H9c2的缺氧培養上清可以誘導內皮細胞HUVEC表達ICAM-2。通過細胞因子刺激實驗以及測定兩種因子的含量發現,PDGF-BB和PDGF-AB可以刺激HUVEC表達ICAM-2,同時PDGF-BB在缺氧上清中較正常培養上清中增高,而 PDGF-AB相反。上述結果提示,H9c2在缺氧條件下產生的因子PDGF-BB是其中起作用的物質。

ICAM-2在內皮細胞和血小板高表達,最初是以白細胞整合素、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)的反受體被克隆發現的。同時它也是樹突細胞特異ICAM結合非整合素蛋白(DC-SIGN)的反受體[4]。近來研究發現 ICAM-2在血管發生中有重要作用。在內皮細胞ICAM-2的表達能被細胞間接觸和生長因子調節,體內和體外實驗表明ICAM-2的缺失導致血管生成減少,ICAM-2集中分布在細胞間連接處,通過同分子相互作用參與內皮形成管狀結構和血管生成。同時,ICAM-2通過抑制內皮細胞凋亡的發生,調節Rac活化,促進血管生成[5]。但是,在心肌梗死后的血管生成中內皮細胞表面的ICAM-2是如何受到細胞間相互作用調節的尚不清楚。在人臍靜脈內皮細胞,研究發現 TNF-α和IL-1β可以在轉錄水平下調ICAM-2的表達[6]。在人虹膜微血管內皮,內皮素和TNF-α刺激下可以被緩慢下調ICAM-2的表達[7]。本研究結果提示,缺氧心肌細胞產生的PDGF-BB可能刺激ICAM-2的表達。

PDGF-BB是血小板衍生生長因子(PDGF)的一種亞型。PDGF有同源雙聚體(PDGF-AA,PDGF-BB)和異源雙聚體(PDGF-AB)等三種亞型,其中PDGF-BB促新生血管化的作用最強[8]。PDGF-BB及其受體在微血管內皮細胞表達、調節內皮細胞增殖和遷移,有利于血管發生。PDGF不僅作用于內皮細胞,也可作用于管壁其他細胞,如間質細胞和平滑肌細胞的分化和分裂,從而形成完整的血管[9]。本研究提示,PDGF-BB可以介導缺氧心肌和內皮細胞間的相互作用,使內皮細胞ICAM-2的表達增加。而ICAM-2的表達被證實在血管發生中有重要作用[5]。因此,缺氧心肌通過PDGF-BB誘導內皮細胞ICAM-2的表達,從而促進血管發生可能是缺血區域的血管新生發生的重要機制。但是,其中的作用通路還需要進一步研究證實,其中的信號通路調節還需要深入的研究。

(致謝:美國哈佛大學醫學院附屬醫院心血管科血管生成研究中心李建教授)

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