大黃素對腦缺血再灌注大鼠的保護作用及機制研究

譚 力,王聯英,向海鷹,李 鳴

卒中是現代社會致死致殘的主要病因之一,其中缺血性卒中占70%以上。但目前除了超早期溶栓治療外,尚無被證明療效確切的藥物[1],因此尋找有效的腦缺血保護藥物成為研究的熱點。大黃素(Emodin)化學名稱1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌,已有文獻報道其具腦缺血保護作用,機制與其對缺血后的炎癥因子的抑制作用有關[2]。但相對于腦缺血損傷復雜的機制,其保護作用及機制的探討尚不全面。本實驗擬采用腦缺血再灌注大鼠模型,在整體和微觀層面觀察大黃素的保護作用,并通過觀察大黃素對缺血后神經元凋亡的影響,進一步探討作用機制,以期為大黃素的運用提供更充實的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組 健康雄性SD大鼠45只,體重250 g～320 g,由湖北民族學院醫學院實驗動物中心提供。隨機分為假手術組、缺血再灌注組、大黃素組,每組15只。假手術組不作任何處理,缺血再灌注組采用線栓法行大腦中動脈阻塞,大黃素組在術前30 min給予大黃素25 mg/kg腹腔注射。

1.1.2 試劑 水合氯醛(中國,國藥試劑),大黃素,焦油紫,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(美國,Sigma),TUNEL檢測試劑盒(德國,Roche),caspase-3活性檢測試劑盒(上海,碧云天)。

1.1.3 儀器 光學顯微鏡(日本,Olympus),電子分析天平(德國,Sartorius),Ultrospec 4000紫外分光光度計(加拿大,SpectraLab Scientific),高速冷凍離心機(美國,Beckman),石蠟切片機(德國,Leica)。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注模型制作 參照Zea longa[3]的大腦中動脈線栓法,采用水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg,IP)麻醉大鼠后,分離出左頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,微動脈夾暫時夾閉頸總動脈和頸內動脈,在頸外動脈兩結扎線間剪一小口,將線栓(栓頭涂有硅膠,直徑0.28 mm)經切口插入頸外動脈、頸內動脈,一直進入17 mm～19 mm時會遇到輕微阻力感,此時結扎備用線將線栓固定在頸外動脈,縫合皮膚。2 h后拔出線栓形成再灌注。假手術組不插入尼龍絲線,其他操作步驟同上。造模成功標準:同側即刻出現Honer征,對側肢體功能障礙。

1.2.2 神經功能缺陷評分 參照Zea longa[3]的方法,缺血2 h再灌注后24 h進行神經功能缺陷評分。評分標準:0分,無功能障礙;1分,不能伸展前肢;2分,向一側旋轉;3分,向一側傾倒;4分,無自主活動伴意識抑制。不足1分者為造模不成功。

1.2.3 腦梗死體積 采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(T TC)染色。缺血2 h再灌注后24 h水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠斷頭取腦,切成厚度為2 mm的腦片,置于2%TTC染液中37℃避光染色15 min,計算機圖像處理系統測量每一腦切片尾側面的梗死面積,將各腦片的梗死面積之和乘以腦片厚度,即為整個梗死灶的體積。

1.2.4 組織病理染色 石蠟切片制作,Nissl染色,TUNEL染色,采用TUNEL試劑盒,按說明書步驟操作。高倍鏡(×400)下每張切片隨機選取5個視野,進行陽性細胞計數。

1.2.5 Caspase-3活性 采用Caspase-3活性檢測試劑盒,缺血2 h再灌注24 h取大鼠腦組織水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,按照每3 mg～10 mg組織加入100μ L裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉移到1.5 mL離心管中,冰浴再裂解5 min,4℃16 000 g離心10 min～15 min后,把上清轉移到冰浴預冷的離心管中,分光光度計測定Caspase-3的活性。

2 結 果

2.1 大黃素減少腦梗死體積及神經功能缺陷評分 與假手術組比較,缺血再灌注組有明顯的神經功能缺損及梗死灶形成。而大黃素則能顯著改善缺血引起的神經功能缺損,減少腦梗死體積,提示大黃素具有腦缺血保護作用。詳見表1。

表1 各組神經功能缺陷評分、腦梗死體積比較(±s)

表1 各組神經功能缺陷評分、腦梗死體積比較(±s)

組別 n 神經功能缺陷(分)腦梗死體積假手術組 5 0 0缺血再灌注組 5 2.82±0.21 181.45±19.37大黃素組 5 2.06±0.141) 120.52±14.501)與缺血再灌注組比較,1)P＜0.01

2.2 大黃素減輕腦組織損傷 Nissl染色顯示假手術組腦組織無水腫、充血,腦組織呈均勻一致的紫藍色,細胞密度大,神經元形態結構完整,為三角形、長條形或多邊形,胞漿染色清晰,尼氏體著藍色,胞核淡染,無明顯神經元丟失;缺血再灌注組大腦皮層可見較明顯的充血,血管周圍間隙增寬,細胞間質水腫,神經元皺縮體積縮小,與周圍組織脫離,胞核固縮深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,部分神經元腫脹,胞漿呈空泡狀;大黃素組可見少量神經元腫脹,少量神經元皺縮、胞核固縮深染,細胞密度較大,與模型組比較神經元損傷減輕、丟失減少,提示大黃素改善腦缺血損傷。

2.3 大黃素減少神經元凋亡 缺血 2 h再灌注24 h的TUNEL染色結果表明,假手術組僅見極少量TUNEL陽性細胞,而缺血再灌注組的陽性細胞數則顯著增多,大黃素組的陽性細胞數明顯減少,提示大黃素對缺血再灌注后的神經元凋亡具有抑制作用。詳見表2。

表2 各組T UNEL陽性細胞計數比較(±s)

表2 各組T UNEL陽性細胞計數比較(±s)

組別 n T UNEL陽性細胞計數(細胞數/視野)假手術組 5 8.4±2.4缺血再灌注組 5 87.5±11.3大黃素組 5 33.9±6.01)與缺血再灌注組比較,1)P＜0.01

2.4 大黃素抑制Caspase-3活性 缺血2 h再灌注24 h的結果表明,缺血導致Caspase-3活性顯著升高,從假手術組的0.12±0.07上升到缺血再灌注組的1.33±0.25,大黃素組則顯著降低至0.56±0.11,表明大黃素對缺血引起的Caspase-3活化及其活性升高具有抑制作用。

3 討 論

通過整體和微觀研究,觀察了大黃素的腦缺血保護作用。大黃素能顯著改善缺血2 h再灌注24 h的神經功能缺陷評分,減少腦梗死體積,顯著減輕缺血引起的腦組織損傷。

腦缺血損傷是由腦血流減少或中斷引起的,缺血引起的神經元死亡包括壞死和凋亡兩種途徑[4]。壞死多發生于較嚴重的缺血以及缺血中心,而凋亡多發生于較緩和的缺血以及缺血周邊(或缺血半暗帶),缺血周邊的細胞可存活數小時甚至數天,因此抑制神經元凋亡有利于改善腦缺血損傷[1]。動物實驗表明多種凋亡抑制劑通過抑制缺血周邊或者缺血半暗帶的細胞凋亡而減少腦梗死體積,進而促進神經功能的改善[5]。目前已知細胞凋亡級聯反應包括細胞外病理途徑(死亡受體途徑)和細胞內病理途徑(線粒體途徑)兩種途徑。這兩種途徑都最終依賴于Caspase-3的活化,Caspase-3在凋亡級聯反應中處于核心地位,是凋亡的最終執行者[6]。Caspase-3通常以無活性的酶原形式存在,在上述兩種途徑下被活化,因此抑制Caspase-3活性就能抑制凋亡的發生,多種Caspase-3抑制劑的運用以證明了這一點[7]。本研究于缺血2 h再灌注24 h檢測了大鼠的神經元凋亡,以及Caspase-3的活性,結果表明大黃顯著減少腦缺血區的TUNEL陽性細胞,而這一結果與Caspase-3活性的降低有關。

大黃素能改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能缺陷評分,減少腦梗死體積,減少神經元凋亡,而這一作用與大黃素對Caspase-3活性的抑制作用有關。

[1]巫志峰,羅翠霞,孫靜,等.大黃素對缺血性中風大鼠腦組織NF-κ B、ICAM-1基因表達的影響[J].中國中醫急癥,2009,18(6):934-936.

[2]Fisher M.The ischemic penumbra:Identification,evolution and treatment concepts[J].Cerebrovasc Dis,2004,17(Suppl 1):1-6.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]Dirnagl U,Iadecola C,M oskowitz MA,et al.Pathobiology of ischaemic stroke:An integ rated view[J].Trends Neurosci,1999,22(9):391-397.

[5]Lei B,Popp S,Capuano-Waters C,et al.Lidocaine attenuates apoptosis in the ischemic penumbra and reduces infarct size after transient focal cerebral ischemia in rats[J].Neuroscience,2004,125(3):691-701.

[6]Ferrer I,Planas AM.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:Life and death struggle in the penumbra[J].J Neuropathol Ex p Neurol,2003,62(17):329-339.

[7]Brien T,Lee D.Prospects for caspase inhibitors[J].Mini Rev Med Chem,2004,4(2):153-165.