艾芬地爾對腦缺血再灌注大鼠A IF表達及神經元凋亡的影響

王彥平 楊金升 范 磊 張明磊 司江華 曲傳勇

近期研究表明,細胞凋亡在腦損傷后的神經細胞死亡中起重要作用[1]。本實驗對局灶性腦缺血再灌注大鼠給予艾芬地爾治療,應用脫氧核糖核苷酸末端標記法(term inal deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL)及免疫組化染色法,比較假手術組、對照組與艾芬地爾組之間神經元凋亡與AIF的表達,探討艾芬地爾對缺血再灌注后神經細胞凋亡的影響,為其治療腦缺血提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 健康雄性W istar大鼠66只,鼠齡3～4個月,體重250～320 g,由甘肅省中醫學院實驗動物中心提供,并隨機分為：假手術組6只,對照組和艾芬地爾組應用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,缺血時間為2 h,再灌注時間為6、24 、48、72、168 h,每個時間點為 6 只大鼠。剔除死亡和蛛網膜下腔出血大鼠后,隨機補充以滿足每組實驗只數。

1.2 材料與試劑 A IF兔多克隆抗體(購自北京博奧森生物技術有限公司),即用型SABC免疫組化染色試劑盒(購自北京中杉生物技術有限公司),TUNEL凋亡檢測試劑盒(購自Roche公司)。

1.3 局灶性腦缺血再灌注模型的建立

模型制作根據Nagasaw a等的改良線栓法制成大鼠大腦中動脈缺血模型[2]。簡要過程如下：用10%的水合氯醛(30mg/100 g體重)腹腔注射麻醉大鼠后,將其仰臥固定,分離右側頸總動脈(CCA),頸內動脈(ICA)及頸外動脈(ECA),結扎 ECA與CCA近心端,用微型動脈夾夾閉CCA遠心端后,迅速于ECA與ICA分叉下方約5 mm處剪一小口,將一預先用酒精燈燒成圓頭的尼龍魚線(直徑0.175 mm)插入頸內動脈,插入深度為(18.5±0.5)mm,直到有輕微阻力感為止,實現大腦中動脈阻塞缺血;結扎插線入口處,尼龍魚線外留約1 cm,縫合皮膚;2 h后輕輕提拉所留線頭至略有阻力,實現大腦中動脈再灌注,造模完成;動物清醒后出現 Horner征,提尾右前肢屈曲或爬行向左側轉圈者為手術成功標志。假手術組除插線1 cm外,其余步驟同對照組。

1.4 給藥劑量及方法 艾芬地爾注射液由重慶人本拉思藥業有限公司提供(5 mg/支)。艾芬地爾組大鼠于缺血再灌注前30 min給予腹腔注射艾芬地爾注射液10 m g/kg,此后每天腹腔注射藥物1次,直至大鼠處死,假手術組和對照組根據體重同步注射相應劑量的生理鹽水。

1.5 標本采集和組織切片的制備 假手術組于手術后24 h取材,其余各組在相應時間點取材。用10%的水合氯醛(30 mg/100 g體重)腹腔注射麻醉大鼠后,經左心室插管,剪開右心耳,依次灌注生理鹽水、40 g/L多聚甲醛各300 m l,斷頭取腦,置入40 g/L多聚甲醛固定12 h,于視交叉后1～4 mm之間取材,厚約3 mm,常規石蠟包埋,冠狀面連續取材,取齒狀回與海馬互包平面的切片,片厚6μm 。

1.6 AIF的免疫組化標記 免疫組化采用SABC法。石蠟切片脫蠟至水,放入檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中,微波熱修復15 min,3%H2 O2 37°孵育 10 min,10%山羊血清封閉,37°孵育 10 min,傾去血清,勿洗,滴加1∶200兔抗鼠A IF抗體,4℃冰箱孵育過夜,37℃復溫1 h,滴加適量生物素標記山羊抗兔二抗工作液,37℃孵育20min;滴加適量的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液,37℃孵育15 min。除血清封閉外,其余步驟間均用PBS沖洗3次,每次5 min;DAB顯色劑顯色2～5 m in;自來水沖洗,蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片;顯微鏡下觀察細胞核中出現棕黃色顆粒者為AIF陽性細胞。陰性對照取PBS代替一抗,免疫反應陰性,說明一抗的特異性較強。

1.7 凋亡細胞檢測 按照TUNEL試劑盒提供的實驗步驟進行操作。用二甲苯浸洗2次,每次5 min;用梯 度酒 精(100%、95%、90%、80%、70%)脫水,每次3 min;PBS漂洗 2次,每次5 min;用細胞通透液(0.1%T riton X-100溶于蒸餾水,臨用前配制)37℃反應8～10min;PBS漂洗2次;制備體積比為 1∶9的 TdT和熒光素標記的 dUTP TUNEL反應混合液混勻;玻片干后加50μl TUNEL混合液(陰性對照組僅加50μl熒光素標記的dUTP液)于標本上,在暗濕盒中反應(37℃×1 h);PBS漂洗3次;加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞(激發光波長為450～500 nm,檢測波長為515～565 nm)并照相;玻片干后加50μl converter-POD在37°暗濕盒中反應33min,PBS漂洗3次;在組織處加50μl新鮮配制的DAB底物,室溫下反應5～10 min;PBS漂洗3次;每次漂洗為5 m in;蘇木素復染50秒后立即用自來水沖洗;梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察出現棕黃色顆粒為陽性(凋亡)細胞。顯微鏡下觀察頂葉皮質缺血半暗帶,取5個非重疊視野,以計數凋亡細胞數/視野。

2 結 果

2.1 AIF的表達 A IF陽性細胞呈棕黃色,假手術組大鼠腦組織中未見明顯AIF陽性細胞。對照組與艾芬地爾組各亞組A IF陽性細胞數在缺血再灌注6 h開始升高,48 h達到高峰,隨后下降;對照組與艾芬地爾組在相同時間點及其組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05,表1)。

2.2 凋亡細胞檢測 DAB顯色后出現棕黃色顆粒者為凋亡細胞,正常細胞核無著色,主要在缺血周圍區,假手術組未見明顯的凋亡細胞。對照組與艾芬地爾組各亞組大鼠凋亡細胞數在缺血再灌注6 h開始升高,48 h達到高峰,隨后下降;對照組與艾芬地爾組在相同時間點及其組間比較,差異均有統計學意義(P＜0.05,表2)。

表1 大鼠缺血再灌注后AIF陽性細胞數的變化(±s,n=6,個/每 200倍視野)

表1 大鼠缺血再灌注后AIF陽性細胞數的變化(±s,n=6,個/每 200倍視野)

注 ：與對照組比較,*P＜0.05

AIF陽性細胞數組別I/R 6 h I/R 24h I/R 48h I/R72h I/R 168 h對照組 74.87±7.17 124.53±9.09 130.47±11.32 84.13±8.96 30.27±4.79艾芬地爾組 61.87±5.73*91.93±7.75*103.87±9.80*71.87±7.80*23.20±4.76*

表2 大鼠缺血再灌注后凋亡細胞數的變化(±s,n=6,個/每 200倍視野)

表2 大鼠缺血再灌注后凋亡細胞數的變化(±s,n=6,個/每 200倍視野)

注 ：與對照組比較,*P＜0.05

組別 凋亡細胞數I/R 6 h I/R 24 h I/R 48 h I/R72 h I/R 168 h對照組 58.03±6.41 102.50±9.54 118.53±11.67 76.20±8.11 23.33±5.16艾芬地爾組 48.30±5.09*81.33±8.29*92.27±9.39*65.93±7.58*16.70±4.16*

3 討 論

腦缺血再灌注損傷的發生是多種因素及多種機制參與的復雜病理生理過程,細胞凋亡是腦缺血再灌注后神經元損傷死亡的一種重要形式。由于通過藥物可以干擾某些環節,抑制凋亡通路,達到保護神經元缺血性損傷的目的,所以選擇藥物干預,通過觀察其對神經元凋亡及調控凋亡因子的影響,判斷其對神經元的保護作用,可為指導臨床治療腦梗死提供理論依據。

細胞凋亡的發生涉及到能量的減少、興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載、自由基釋放、線粒體的損傷等,但就其機制來說有caspase依賴途徑及AIF介導的非caspase依賴途徑。AIF是近年來發現的一種凋亡效應分子,它是一種在進化上較為保守的黃素蛋白,定位于細胞線粒體膜間隙,具有凋亡誘導的活性。A IF是一種雙功能蛋白,具有氧化還原酶的活性,與線粒體的生理活動有關[3],它在不依賴caspase途徑的細胞凋亡過程中扮演重要角色。

凋亡的發生既與凋亡相關基因表達有關 ,又受許多因素的調節。在眾多因素中興奮性氨基酸受體的過度激活是引起缺血神經元死亡的主要因素 。興奮性氨基酸毒性不僅引起神經元急性壞死 ,同時也誘導細胞凋亡,其機制可能與NMDA受體的激動有關,有研究表明慢性NMDA的應用可增加促凋亡因子和減少抑凋亡因子的作用[4]。谷氨酸是缺血后興奮性氨基酸中早期釋放的氨基酸,并且是哺乳動物中樞神經系統興奮性氨基酸的主要成份[5],谷氨酸的結合位點是由NR2B組成的,因此可以說NR2B亞基在凋亡通路中起關鍵作用。有研究表明,激動NR2B亞基可增加神經元凋亡,在腦卒中前及腦卒中4.5h內應用NR2B受體拮抗劑可減少梗死體積[6]。體外培養的大鼠前腦的原始細胞用十字孢堿誘導凋亡,結果只有20%的細胞存活,用選擇性NMDA受體NR2B亞基拮抗劑干預時細胞存活率可高達78%,選擇性NR2B受體拮抗劑可明顯提高細胞存活率[7]。

艾芬地爾為NMDA受體NR2B亞基選擇性受體阻滯劑,并且艾芬地爾的藥物療效具有劑量依賴性[8]。因此,適量艾芬地爾的應用可以抑制谷氨酸的興奮性毒性,阻止其繼發的一系列病理生理變化。本實驗結果表明艾芬地爾使AIF表達減弱,凋亡細胞明顯減少,可能機制為NMDA受體NR2B亞基激活后,繼發鈣超載,自由基、一氧化氮升高,炎癥介質的釋放等,最終導致線粒體的損傷,使PT通道開放,CytC及A IF釋放到胞質中[9,10]。CytC引發caspase家族成員活化,引起細胞凋亡,AIF分子帶有核定位序列,引導AIF向細胞核轉位,引起DNA的片段化反應[11],導致細胞凋亡;應用選擇性NR2B受體拮抗劑艾芬地爾可以抑制谷氨酸的興奮性毒性,使AIF釋放減少,抑制AIF介導的細胞凋亡,并且可減少NR2B亞基的表達[12],從而起到腦保護作用。

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