缺血后處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷熱休克蛋白70影響

邢變枝 陳 暉 張蘇明

在缺血性腦卒中的治療中恢復梗死區的血液供應往往加重組織細胞功能代謝障礙及結構破壞,即再灌注損傷,尋找有效的細胞保護方法是臨床上急待解決的問題。缺血后處理是指在缺血發生后長時間的再灌注之前對臟器進行數次短暫的再灌注/缺血循環的處理方法。與缺血預處理一樣,缺血后處理能夠減輕再灌注后臟器損傷[1～3],近年發現HSP70也可對腦缺血再灌注損傷發揮重要的保護作用[4～6],但HSP70是否參與了缺血后處理誘導的保護機制有待進一步證實。本研究先前工作證實缺血后處理可以減輕腦的再灌注損傷[7,8],但其具體機制目前少見報道。本研究觀察缺血后處理對皮質內HSP70表達的影響,探討腦缺血后處理可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 HSP70、β-actin單克隆抗體購自Senta cruz公司。引物由上海英俊生物有限公司提供。

1.2 實驗分組 8周齡雄性SD大鼠45只,體重250～280 g,由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供,隨機分為假手術組(sham)、缺血再灌注組(I/R)、缺血后處理組(Postcond),每組各15只。

1.3 模型建立 大鼠均采用Koizumi等線栓法經右側頸外一頸內動脈插線建立右側大腦中動脈阻塞(m iddle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型[9]。栓線采用4-0尼龍單線,以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定,分離并暴露右側頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸內動脈(internal carotid artery,ICA)和頸外動脈(external carotid artery,ECA),結扎并切斷ECA及其分支,沿根部結扎ICA顱外分支翼腭動脈;由ECA殘端插入一根尼龍單線,沿 ECA、CCA分叉部和ICA輕輕推進,至ICA顱內分叉處時可阻斷流入MCA的血流,進線長度18～20 mm;缺血時間為60 min,隨后抽出插線使血流恢復實現再灌注。假手術組除不插線外,余步驟同上。缺血后處理組在MCAO 60min后將尼龍線拔出5mm,再灌30s后再將尼龍線放入初始位置,缺血30 s,反復6次[7,8]。

1.4 標本采集和處理 于再灌注24 h后一部分大鼠斷頭留取腦組織,速置液氮中保存待測,另一部分大鼠用4℃的40 g/L中性多聚甲醛灌流固定,斷頭取腦,于視交叉后1mm沿冠狀位切片,制備石蠟切片。

1.5 免疫組化檢測HSP70的表達水平 將石蠟切片再以新鮮配制的體積分數為3%的H2 O2滅活細胞內源性過氧化物酶,然后用血清封閉,根據測試指標分別滴加抗HSP70單克隆抗體(1∶500稀釋)以及相應生物素化二抗,DAB顯色,封片。應用同濟千屏HPIAS2000型圖像分析系統對免疫組織化學染色涂片進行分析。

1.6 Western blot檢測腦皮質中HSP70蛋白含量

取液氮保存的右腦皮質組織,參照Matsumori等方法提取蛋白[10]。蛋白用考馬斯亮藍法定量,100℃加熱5 min,取40μg/lane上樣行電泳,樣本用15%Tris-Glycine膠電泳分離蛋白后,電轉到硝基纖維膜上,5%的脫脂牛奶封閉2 h,以1×TBST洗滌后與HSP70單克隆抗體(1∶500)4℃過夜,1×TBST洗滌后HRP標記的羊抗小鼠二抗(1∶2000),室溫孵育1 h,TBST洗滌后混合等體積的試劑盒(Senta cruz)A液和B液,與硝基纖維膜共孵育1min,與X光片曝光1 h,顯影、定影。用同樣方法標記鼠單克隆抗體βactin作為胞漿蛋白內參照。

1.7 RT-PCR檢測腦皮質中HSP70m RNA表達水平

取液氮保存的右腦皮質組織,采用Trizol一步法提取細胞總RNA,逆轉錄成cDNA。大鼠HSP70正義和反義引物分別為5'-GGGTTTGGGTACTTTGGTTA-3',5'-CCCATAAGTTGGGAAACAGT-3',擴增產物為317 bp;以β-actinmRNA 為內參照,其正義和反義引物為5'-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3',5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3',其產物為 285 bp。PCR條件為94℃預變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,擴增35個循環;最后一次為72℃延伸7min。取5 ul產物在含GOLDV IEW 的瓊脂糖凝膠上(2%)電泳,用凝膠圖像分析系統進行半定量分析,結果以目的基因β-actin比值表示。

1.8 統計學處理

實驗所得數據以均數±標準差表示,應用SPSS軟件(11.5版),采用方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

HSP70主要表達在細胞質。假手術組腦皮質組織神經細胞HSP70表達不明顯或不表達(圖1),缺血再灌注組和缺血后處理組缺血區腦皮質組織神經細胞表達較高,但是缺血后處理組腦皮質組織神經細胞HSP70表達顯著高于缺血再灌注組(圖1)。

圖1 各組HSP70免疫組化染色(×400)倍

Western blot檢測顯示：假手術組無明顯HSP70表達,蛋白條帶僅有清淡顯影。缺血再灌注損傷24 h后,缺血再灌注組缺血再灌注區皮質內HSP70合成增加,缺血后處理組缺血再灌注區皮質內HSP70的合成較缺血再灌注組明顯增多(P＜0.05)(圖2)。β-actin作為胞漿成分加等量蛋白的質控。

圖2 Western b lot檢測腦皮質組織中HSP70表達變化 與假手術組比較,*P＜0.05;與缺血再灌注組比較,#P＜0.05

RT-PCR檢測顯示假手術組大鼠大腦皮質內有微量的HSP70m RNA表達,缺血再灌注損傷24 h后缺血再灌注組缺血再灌注區大腦皮質內HSP70 mRNA表達增強(P＜0.05),應用缺血后處理后缺血再灌注區大腦皮質內HSP70m RNA表達明顯增強,顯著高于假手術組和缺血再灌注組(P＜0.05)(圖 3)。

3 討 論

研究發現缺血預處理能夠降低缺血再灌注損傷,然而在臨床實踐中患者往往在出現缺血后才就診,因此尋找一種腦缺血事件發生后的保護方法,具有十分重要的臨床實用價值。缺血后處理發生在缺血事件后具有可控性,因此具有較大的臨床價值。最早發現缺血后處理對心臟的保護作用[1],近年來國內外學者報道缺血后處理可以減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷[11,12],這和本研究先前的研究結果一致[7,8],但這一現象發生的機制仍然不清楚。本實驗研究發現HSP70表達水平在缺血后處理組中明顯升高,可能參與后處理保護效應。

圖3 RT-PCR檢測腦皮質組織中HSP70mRNA表達變化 與假手術組比較,*P＜0.05;與缺血再灌注組比較,#P＜0.05

HSP70是一類最保守、最重要的HSPs,在正常細胞中水平較低,而在應激狀態下顯著升高,在缺血、缺氧等情況下例如局灶及全腦缺血后受損細胞內的變性蛋白可誘導HSP70表達。核蛋白變性,暴露出疏水區,并相互作用而聚合,并且與自胞質進入到胞核內的少量HSP70結合,使得本來與HSP70結合的熱休克轉錄因子(HSF)分離,轉移到胞核中與HSP70基因啟動子中特定的核苷酸序列即熱休克元件(HSE)結合,從而啟動HSP的轉錄,HSP70 m RNA轉移到核外大量合成 HSP70,在胞質中與變性蛋白結合,維持蛋白自身穩定;進入核內與核糖體前體及其他核內蛋白結合,防止變性引起生命信息紊亂[13]。

近來的研究證實,在腦缺血再灌注損傷中HSP70的合成增加與缺血耐受現象的產生關系密切,其機制包括降低ROS的產生、抑制炎癥反應[4]、維持線粒體膜的穩定性[5]、抗神經元凋亡[6,14]等。本實驗結果顯示,假手術組僅有少量HSP70表達,缺血再灌注組表達明顯,與假手術組比較有顯著差異,這是由于缺血本身為一種應激反應,可誘導HSP70表達,這也是機體調動內源性保護機制,而發揮細胞保護作用。在缺血后處理組HSP70表達明顯增強,提示刺激HSP70表達水平升高可能是缺血后處理的保護機制之一。因此本研究認為缺血后處理的保護作用可能是通過多次循環復灌復停減少了突然再灌注,從而促進HSP70 mRNA的轉錄和HSP70蛋白的翻譯,進而保護線粒體,減少炎性因子的表達,抑制神經細胞凋亡等途徑而發揮保護作用。

由于缺血后處理可在臟器缺血后應用,所以具有較大的臨床應用價值。但是缺血后處理究竟通過什么分子途徑刺激HSP70的表達和合成還有待進一步研究。研究如何啟動腦缺血時機體的內源性神經保護作用,有助于尋找腦缺血的有效治療途徑,對防治腦梗死后再灌注損傷具有積極意義。

1 Zhao ZQ,Corvera JS,HalkosME,et al.Inhibition ofmyocardial in jury by ischem ic postconditioning during reperfusion：comparison w ith ischem ic preconditioning.Am JPhy siol H eart Circ Physiol,2003(3),285(3)：579-588.

2 Zhao H,Sapolsky RM,Steinberg GK,etal.Interrup ting reperfusion as a stroke therapy：ischem ic postconditioning redu ces infarct size after focal ischem ia in rats.JCereb Blood Flow Metab,2006,26(9)：1114-1121.

3 Liu X,Chen H,Zhan B,et al.A ttenuation of reperfusion injury by renal ischem ic postconditioning：The role of NO.Biochem ical and Biophysical Research Communications,2007,359(3)：628-634.

4 Zheng Z,K im JY,Ma H,et al.An ti-inflammato ry effects of the 70kDa heat shock protein in experimen tal stroke.JCereb Blood Flow Metab,2008,28(1)：53-63.

5 Ouyang YB,Xu LJ,Sun YJ,et al.Overexpression of inducible heat shock p rotein 70 and itsmutants in astrocytes is associated w ith m ain tenance of m itochond rial physiology during glu cose deprivation stress.Cell Stress&Chaperones,2006,11(2)：180-186.

6 JohannesG,Lassmann MH,Johansen FF.An ti-apop totic signaling and failure of apoptosis in the ischem ic rat hippocampus.Neurobiology of Disease,2007,25(3)：582-593.

7 Xing B,Chen H,Zhao D,et al.Ischem ic postconditioning inhibits apoptosis after focal cereb ral ischem ia/reperfusion inju ry in the rat.Stroke,2008,39(8)：2362-2369.

8 Xing B,Chen H,Zhao D,et al.Ischem ic postconditioning p rotectsb rain and reduces inflamm ation in a rat model of focal cereb ral ischem ia/reperfusion.Journalof neurochem istry,2008,105(5)：1737-1745.

9 Korzum i J,Yoshida Y,Nakazaw a T,et a1.Ex perimentalstudies of ischem ic brain edema.A new experimen talm odel of cereb ral embolism infarcts in the ischem ic area,Stroke,1986,8(5)：l-8.

10 Matsumori Y,Hong SM,Aoyama K,et al.H sp70 overex pression sequesters A IF and reduces neonatalhypoxic/ischem ic b rain in jury.JCereb Blood Flow M etab,2005,25(7)：899-910.

11 熊利澤,楊 靜,徐 寧,等.缺血后處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響.中華麻醉學雜志,2005,7(2)：508-510.

12 Pignataro G,Meller R,Inoue K,et al.In vivo and in vitro characterization of a novelneuroprotective strategy fo r stroke：ischem ic postconditioning.JCereb Blood Flow Metab,2008,28(2)：232-241.

13 Soncin F,Zhang X,Chu B,et al.Transcriptional activity and DNA binding of heat shock factor-l involve phosphorylation on th reonine 142 by CK2.Biochem Biophys Res Commun,2003,303(2)：700-706.

14 鮑 娟,楊期東,羅紅波,等.替普瑞酮誘導AD模型大鼠海馬HSP70表達及其神經保護作用的研究.卒中與神經雜志,2008,15(2)：80-82.