兩種羊膜脫細胞基質制備方法的比較*

雷寧靜，胡 煒，王成春，朱根明，楊琳琳，關方霞#

1)鄭州大學生物工程系鄭州450001 2)鄭州大學第一附屬醫院神經外科鄭州450052

生物活性材料可用于修補受損組織和大面積缺損，是組織工程的研究熱點。羊膜具有免疫原性極低，排異反應小，可分泌多種生長因子并含有多種炎性因子及新生血管抑制因子等生物學特性，是一種良好的生物活性載體［1］。羊膜脫細胞基質是一種特殊的細胞外基質，作為細胞培養的生物載體，特別是作為生物活性載體，已用于干細胞體外培養。又因其免疫原性低而廣泛用于眼科、臨床燒傷外科及骨科等皮膚、黏膜及神經重建移植研究［2］。作者采用2種改進方法進行羊膜脫細胞基質的制備，比較其脫細胞效果，并用于臍帶間質干細胞的體外培養，觀察臍帶間質干細胞與羊膜脫細胞基質的生物相容性，為進一步進行組織工程研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 基礎培養基［體積比1∶1的DMEM/F12培養液，體積分數10%胎牛血清，20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)］，青、鏈霉素，胰蛋白酶，EDTA，TritonX-100，倒置顯微鏡 IX71(日本Olympus公司)，細胞培養箱，超凈工作臺，掃描電鏡。

1.2 羊膜脫細胞基質的制備 無菌條件下取正常足月剖宮產胎兒胎盤(鄭州大學第一附屬醫院)，采取前征得產婦知情同意，實驗經醫院倫理委員會批準。鈍性分離羊膜約10 cm×10 cm，去除絨毛膜組織，保留羊膜層。

①Triton法:新鮮羊膜經生理鹽水反復沖洗干凈后置于體積分數0.1%TritonX-100溶液中，振蕩，置于恒溫培養箱中保存36 h，取出后用生理鹽水漂洗干凈。加入25 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA，充分振蕩，37℃保存4 h。取出后用生理鹽水漂洗干凈，裁剪成1 cm×1 cm大小后分裝密封。

②甘油法:新鮮羊膜沖洗干凈后置于培養皿中甘油浸泡，4℃保存，24 h×3次;生理鹽水反復沖洗干凈，25 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA 4℃作用10 h。取出后用生理鹽水漂洗干凈，裁剪成1 cm×1 cm大小后分裝密封。

1.3 臍帶間質干細胞的制備及傳代 將上述胎盤所附帶的臍帶剪成約2 cm的段狀，用生理鹽水沖洗干凈。剝去臍帶內兩條動脈和一條靜脈，再用生理鹽水充分洗滌，剪碎成泡沫狀，移液管吸取適量的臍帶組織至培養瓶中，加入已配置好的培養基(DMEM/F12培養液，體積分數10%的胎牛血清，體積分數0.67%bFGF，體積分數1%的青、鏈霉素)，吹打均勻后置于37℃、飽和濕度、體積分數5%CO2培養箱中培養。3～4 d更換培養液一次。待細胞生長達到80% ～90%融合鋪滿瓶底時，進行細胞傳代。

1.4 羊膜脫細胞基質性狀觀察

1.4.1 殘余細胞數 2種羊膜脫細胞基質各取6張樣本置于載玻片上，HE染色，100倍鏡下每張選取10個不同視野，采用網格計數法計數相同面積內的殘余細胞數，重復實驗3次。鏡下觀察到深藍染色者計數為1個殘余細胞。

1.4.2 電鏡觀察 用生理鹽水將羊膜脫細胞基質清洗干凈，然后用體積分數0.25%戊二醛固定，送檢，掃描電鏡下觀察2種脫細胞基質的形態。

1.4.3 臍帶間質干細胞在羊膜脫細胞基質上的生長狀況 2種羊膜脫細胞基質用培養液預濕，展開置于6孔板內，將傳至第3代的人臍帶間質干細胞懸液(2×105mL－1)0.2 mL接種于脫細胞基質，加入 4.8 mL DMEM/F12 培養液，0.03 μL bFGF，置于37℃、飽和濕度、體積分數5%CO2培養箱中培養，隔日換液，HE染色，倒置顯微鏡下觀察細胞黏附情況。將第3代人臍帶間質干細胞以4×104mL－1分別接種在底部包被2種基質的24孔板中，用基礎培養基培養，每隔24 h取6孔，胰酶消化混合后重懸細胞，臺盼藍染色，計數活細胞總數，重復3次，取平均值為當天的活細胞計數，共計數4 d。

1.5 統計學處理 應用SPSS 12.0處理數據，2種殘余細胞數及臍帶間質干細胞活細胞計數的比較用成組資料的t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2種羊膜脫細胞基質形態的比較 2組脫細胞后的羊膜均為白色透明的膜狀物，柔韌性好。HE染色可見，2種脫細胞基質表面無藍色核染物質(圖1A、B)。掃描電鏡下觀察，2種脫細胞基質亦未見細胞殘留;Triton組羊膜脫細胞基質可見縱橫交錯的編織狀纖維;甘油組樣本表面凹凸不平，看不到細胞形態(圖1C、D)。Triton組殘余細胞數為(1.13±0.35)，甘油組為(1.11 ±0.22)，2 組間差異無統計學意義(t=1.920，P=0.888)。

圖1 2種羊膜脫細胞基質形態觀察

2.2 臍帶間質干細胞在2種羊膜脫細胞基質上的生長狀況 臍帶間質干細胞約6 h即可在2種羊膜脫細胞基質表面黏附。2組細胞增殖情況見表1。

表1 2組臍帶間質干細胞活細胞計數結果 104mL－1

3 討論

生物載體材料是組織工程研究的基礎，目前，生物載體材料主要有兩大類，一類是人工合成材料，另一類是天然生物材料。與人工合成材料相比，天然生物材料具有無法比擬的優點:一方面，天然生物材料直接取自生物體內，有良好的生物相容性和生物可降解性，且降解產物無毒副作用;另一方面，天然生物材料本身就具有相同或類似于細胞外基質的結構，可促進細胞黏附、增殖和分化［3］。因此，天然生物材料已成為人們研究的熱點。

目前臨床上使用的羊膜主要為新鮮羊膜、深冷保存羊膜和脫細胞羊膜(也稱羊膜脫細胞基質)。國外多采用深低溫(－80℃)保存的含有上皮細胞的羊膜，因技術工藝要求復雜，保存成本過高，不為國內所采用。羊膜脫細胞基質不含羊膜上皮細胞，保留了羊膜基底膜與致密層，它的主要成分是Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型膠原蛋白，蛋白多糖和糖蛋白，是一種天然的細胞外基質，可能是良好的組織工程生物載體材料。然而，目前常用的羊膜脫細胞處理方法是胰酶酶解及物理方法［4］，膜制備過程中可能會產生二次污染，并且過度酶解會破壞羊膜基質的蛋白結構及韌性，器械處理也可能會對羊膜造成損傷。這些不足均降低了羊膜脫細胞基質作為天然細胞外基質的優越性。

作者采用2種方法處理新鮮羊膜，一組使用TritonX-100和酶消化法進行處理，該方法操作簡單，用時較短(約需2 d);另一組使用甘油浸泡和酶消化法進行處理，操作也簡單，耗時較長(約需4 d)。TritonX-100是常用的非離子性表面活性劑，能溶解脂質。甘油的重要特點之一是無毒無刺激，不會對生物組織造成傷害。2種方法得到的羊膜脫細胞基質均無細胞殘留，均對臍帶間質干細胞有良好的細胞相容性，但是臍帶間質干細胞在Triton組羊膜脫細胞基質上的細胞增殖情況明顯優于甘油組。從電鏡掃描結果可看出，TritonX-100處理的羊膜可見縱橫交錯的編織狀纖維，不含壞死組織，基質成分完整，三維結構清晰;而甘油處理的樣本盡管無細胞殘留，但無法觀察到縱橫交錯的編織狀纖維，其三維結構塌陷，原因可能為甘油強力脫水后影響三維結構及胰酶處理時間過長，影響基質的蛋白結構從而影響三維結構。據文獻［5］可知，細胞的生長增殖不僅與培養基及生長因子相關，而且與所貼敷材料的空間物理結構有關，種植材料表面的理化性質能影響生物大分子層的結構、組成和空間構象，進而導致不同的細胞學表現。

綜上所述，作者認為，TritonX-100預處理并酶消化法是制備羊膜脫細胞基質較好的方法。

［1］蔡瓊霞，熊華鋒，胡葵葵，等.臍血間充質干細胞分離培養的理論研究與應用［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(28):5 630

［2］宋永周，崔慧先，王振顯，等.羊膜脫細胞基質的制備及其生物相容性［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(1):51

［3］杜心欣，瓦龍美.天然生物材料在皮膚組織工程中的應用［J］.醫學綜述，2006，12(9):515

［4］肖光禮，聶衛，高萍，等.脫細胞羊膜制備及生物學評價［J］.臨床醫學工程，2009，16(1):1

［5］張春寶，陳富林，張蓉，等.Ti-75合金對人成骨細胞的生長、增殖和功能分化的影響［J］.實用口腔醫學雜志，2000，16(1):24