5-氟尿嘧啶固體脂質納米粒對S180腹水瘤小鼠的抑瘤作用*

梁春麗，沈國鵬#，王舒雨，杜 斌

1)鄭州大學化工與能源學院制藥工程系鄭州450001 2)鄭州大學藥學院鄭州450001

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是常用的化療藥物，由于其半衰期短，不良反應較多，腹腔內局部給藥后不能在腹腔內保持長時間的有效濃度，從而影響腹腔內的化療效果。固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是20世紀90年代初發展起來的新一代亞微粒給藥系統，以毒性低、生物相容性好、生物可降解的固態天然或合成的類脂為載體，將藥物吸附或包裹于脂質膜內，具有可以控制藥物釋放、避免藥物的降解或泄漏以及良好的靶向性等優點［1］。作者以S180腹水瘤小鼠為模型，觀察5-氟尿嘧啶固體脂質納米粒(5-FU-SLN)對腹水瘤模型小鼠腹腔內化療的效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 JJ500型精密電子天平(美國雙杰兄弟有限公司)，電子數顯游標卡尺(北京北瑞科信儀器有限公司)，手術器械(張家港市雙鹿醫療器械有限公司)，TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠)，XSP3A單目顯微鏡(上海萬衡精密光學儀器廠)。5-FU(常州劍湖化工有限公司，批號:061108，純度≥99%)，空白SLN和5-FU-SLN(鄭州大學納米藥物研究中心制備)，生理鹽水(河南太龍藥業股份有限公司，批號:090522242)。

1.2 動物與瘤株 健康昆明種小鼠(鼠齡4～5周，雌性，體質量18.0～22.0 g)購自河南省實驗動物中心，動物生產許可證號:SCXK(豫)2005-0001;小鼠S180肉瘤腹水型瘤株為中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物與流行病研究所藥學研究室饋贈。

1.3 5-FU-SLN的制備 精密稱取處方量單硬脂酸甘油酯和氫化大豆卵磷脂，加入無水乙醇和氯仿混合溶液(1∶1)，55℃水浴溶解，得到脂質溶液。稱取處方量5-FU，置超純水中超聲水浴溶解制成內水相，同時稱取表面活性劑泊洛沙姆-188適量，溶于PBS溶液中作外水相;控制一定的滴速、轉速，將內水相滴入脂質溶液中，形成W/O型混懸液，滴加完畢后超聲分散;再將其滴入含表面活性劑的同溫度外水相中，攪拌乳化，減壓旋轉蒸發，緩慢除去有機溶劑，200 W超聲分散1 min，形成W/O/W型5-FU-SLN 混懸液［2-4］。

1.4 小鼠腹水瘤模型的建立 取凍存復蘇的S180細胞株在體積分數為5%CO2恒溫箱中培養，傳至2代，用無菌生理鹽水調節細胞數至1×107mL－1，無菌條件下每只小鼠腹腔注射0.2 mL。接種第7天，無菌條件下抽取S180荷瘤小鼠淡黃色癌性腹水，加無菌生理鹽水調整細胞數至1×107mL－1的瘤細胞懸液，經體積分數為0.2%的臺盼藍染色，細胞存活率＞95%。

1.5 動物分組與給藥方法 模型小鼠稱質量后隨機分為生理鹽水對照組、空白SLN組(Blank-SLN組)、5-FU溶液組(5-FU葡萄糖溶液)及5-FU-SLN組，每組20只。5-FU溶液組和5-FU-SLN組給藥劑量為20 mg/(kg·d)，生理鹽水對照組、空白SLN組為等容量生理鹽水和空白SLN懸液。均腹腔注射給藥，1次/d，連續7 d。

1.6 檢測指標 每天觀察各組小鼠的一般情況，隔天測量體質量和腹圍。末次給藥后次日(第8天)，在無菌條件下頸椎脫臼處死各組半數小鼠，用注射器收集腹腔中全部腹水后，測量腹水體積，每只取0.4 mL新鮮腹水，臺盼藍染色后鏡檢計瘤細胞總數和瘤細胞存活率［2］。細胞存活率 =(未染色細胞數/細胞總數)×100%。處死的小鼠解剖觀察腹腔內臟器的病理變化，肝臟組織用體積分數為10%的甲醛固定后，石蠟包埋，HE染色鏡檢。剩余小鼠停止治療，統計平均生存時間，計算生命延長率。生命延長率=(給藥組生存時間/生理鹽水對照組生存時間－1)×100%。

1.7 統計學處理 采用SPSS 15.0進行分析，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較處理7 d后各組小鼠體質量、腹圍、腹水量、瘤細胞數、瘤細胞存活率及平均生存時間和生命延長率。檢驗水準α=0.05。

表1 各組小鼠體質量及腹圍的變化

表2 各組小鼠腹水量、瘤細胞數及瘤細胞存活率比較

2 結果

2.1 一般情況觀察 給藥期間，各組動物飼養環境相同，大部分存活，僅有個別死亡(生理鹽水對照組死亡1只，Blank-SLN組死亡2只，5-FU溶液死亡1只)。開始給藥后2～3 d，生理鹽水對照組荷瘤鼠腹部迅速增大，至第4天時腹部膨隆，進食進水量明顯減少，且活動減少，對外界刺激反應遲鈍，出現活動受限、倦怠乏力等衰竭癥狀，晚期出現明顯的球狀腹，部分小鼠大便異常(便稀，膿血便)，尿液中出現淡黃色黏稠液。Blank-SLN組表現與生理鹽水對照組相近，而5-FU溶液組和5-FU-SLN組小鼠腹部增大出現均較生理鹽水對照組晚，且進展較慢，與正常小鼠相比差異不明顯。

2.2 各組小鼠體質量和腹圍的變化 見表1。

2.3 各組小鼠腹水量、瘤細胞數及瘤細胞存活率比較 生理鹽水對照組和Blank-SLN組的小鼠有大量血性腹水，氣味刺鼻;5-FU溶液組解剖后血性腹水量也較多;5-FU-SLN組有少量淡黃色腹水。各組小鼠腹水量、瘤細胞數及瘤細胞存活率見表2。

2.4 各組小鼠肝臟病理學檢查 生理鹽水對照組、Blank-SLN組及5-FU溶液組小鼠處死后解剖均發現肝臟表面光澤差，灰黃，邊緣鈍，各葉之間有粘連，質脆，有黏性物質和不同程度的淡黃色針尖樣病灶。而5-FU-SLN組解剖后肝臟肉眼觀察各葉之間未見粘連，質地較堅韌，切面未見明顯充血、淤血和針尖樣病灶。肝臟病理切片見圖1。結果顯示:生理鹽水對照組、Blank-SLN組和5-FU溶液組肝臟組織可見較多核深染的癌細胞，排列緊密，有異型性(多邊形、馬蹄形及扁平型);胞核大，胞質較少，核質比明顯異常，可見巢狀結構;多數肝細胞壞死，細胞出現空泡型變性，核固縮現象多。而5-FU-SLN組腫瘤細胞浸潤程度較輕，形態正常無塌陷，異型細胞少，肝臟細胞較為正常。

圖1 各組小鼠肝臟病理形態學變化(HE，×200)

2.5 各組小鼠生存時間與生命延長率 見表3。

表3 各組小鼠生存時間及生命延長率比較

3 討論

腹腔內化療是一種選擇性區域化療方案，該方案能有效增加藥物和腹膜的接觸面積，提高局部藥物濃度，而全身毒副作用較輕。作者發現:5-FU溶液組的體質量增長比5-FU-SLN組緩慢，腹圍增長速度卻比5-FU-SLN組快，可能是由于5-FU溶液腹腔內給藥后藥物選擇性差，代謝快，對骨髓和胃腸道毒性較大，導致動物食欲減退，形體消瘦［5］。5-FUSLN組的腹水量、瘤細胞數都少于5-FU溶液組，且瘤細胞存活率低于5-FU溶液組，提示5-FU-SLN劑型腹腔給藥對腹水瘤的抑制作用比5-FU溶液顯著。5-FU-SLN在腹腔液內緩慢釋放，瘤細胞長時間浸泡在化療藥物中，提高了瘤細胞毒作用，抑制腹腔內的腫瘤細胞增殖，有效地控制瘤細胞擴散，同時延長了小鼠的生存時間。5-FU-SLN組與5-FU溶液組相比未見肝臟轉移，提示5-FU-SLN腹腔給藥對腫瘤腹腔內臟器轉移的抑制作用優于5-FU溶液。肝臟轉移減少的原因可能是固體脂質納米粒容易在肝、脾等網狀內皮系統聚集，藥物在肝、脾中的濃度高，從而抑制了肝臟轉移［6-7］。

總之，作者的實驗結果證實5-FU-SLN腹腔化療在保持腹腔化療優勢的同時，對腹水的抑制作用增強，有效抑制腫瘤細胞的增殖，延長了動物的存活時間，且小鼠腫瘤細胞浸潤程度減輕，肝臟細胞趨于正常。對于5-FU-SLN小鼠腹腔化療的藥代動力學與靶向性，有待下一步深入研究。

［1］陸彬.藥物新劑型與新技術［M］.北京:人民衛生出版社，2002:329

［2］徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2002:1 757

［3］侯君，周世文.甘草酸固體脂質納米粒的處方及制備工藝［J］.第三軍醫大學學報，2008，30(11):1 043

［4］王艷芝，鄭甲信，徐炳欣，等.鹽酸小檗堿固體脂質納米粒包封率的聚結離心法測定［J］.鄭州大學學報:醫學版，2009，44(1):188

［5］姜福全，王強，蔡清萍，等.5-氟尿嘧啶腹腔內緩釋化療對H22腹水瘤小鼠的抑瘤療效觀察［J］.第二軍醫大學學報，2006，27(11):1 207

［6］Jain SK，Chaurasiya A，Gupta Y，et al.Development and characterization of 5-FU bearing ferritin appended solid lipid nanoparticles for tumour targeting［J］.J Microencapsul，2008，25(5):289

［7］Wong HL，Bendayan R，Rauth AM，et al.Chemotherapy with anticancer drugs encapsulated in solid lipid nanoparticles［J］.Adv Drug Deliv Rev，2007，59(6):491