p62增加HBsAg+HepG2細胞DRibbles 中HBsAg 含量的研究

唐明，薛萌，丁磊，曹萌，王立新

(東南大學醫學院病原生物與免疫學系，江蘇南京 210009)

細胞自噬DRibbles(DRips in Blebs)是高度保守的細胞生物學行為，其分子機制從酵母細胞到哺乳動物細胞十分相似。在自噬過程中，待降解的胞漿組分及細胞器被包裹在具有雙層膜結構自噬小體(autophagy)中，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體，實現胞內物質的降解，從而維持細胞自穩。

DRibbles是從腫瘤細胞培養上清提取的具有雙層膜結構的自噬小體，其中含有阻斷蛋白酶體降解途徑而殘留的廢蛋白(defective ribosome products，DRips)。我們前期實驗證明，DRibbles作為腫瘤抗原載體能被DC攝取并通過交叉提呈途徑誘導T細胞應答，它是具有潛在價值的腫瘤疫苗載體［1］。

近來研究發現，p62作為多種信號傳導途徑中的支架蛋白，能通過C末端泛素相關結構域(ubiquitinassociated domains，UBA)與泛素化靶蛋白結合，并通過LRS(LC3 recognition sequence，LRS)結構域與LC3結合，然后由LC3介導將泛素化靶蛋白包裹入自噬小體，最后自噬小體與溶酶體融合完成蛋白的降解。因此，p62在兩種蛋白降解途徑(蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑)之間發揮著重要的橋梁作用［2］。

本研究擬構建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、泛素-HBsAg以及p62真核表達質粒，并轉染HepG2細胞，提取轉染細胞的DRibbles并檢測其中HBsAg含量，探討過表達p62蛋白能否提高自噬小體中泛素化蛋白(HBsAg)的含量，為優化DRibbles腫瘤疫苗提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 質粒和主要試劑

pIRES2-EGFP質粒由東南大學趙春杰教授贈送;pIRES2-EGFP-p62質粒和pCMV-HBsAg質粒由美國波特蘭Franz癌癥研究中心Hong-Ming Hu教授贈送;大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。小鼠泛素表達基因上游引物(Ub-f):5'-CTAGC TAGCA TGCAG ATCTT CGTGA AGAC CCT-3'(含NheⅠ酶切位點)，下游引物(Ub-r):5'-CCGCT CGAGC GCACC TCTCA GGCGA AGGA-3'(含XhoⅠ酶切位點);HBsAg-f:5'-CCGCT CGAGA TGGAG AACAT CGCAT CAGG-3'(含 XhoⅠ酶切位點)，HBsAg-r:5'-CCCGA ATTCT TAAAT GTAT A CCCAA AGACA AA-3'(含EcoRⅠ酶切位點)均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。總RNA提取試劑盒及PCR試劑盒購自Promega公司;反轉錄試劑盒購自Transgen公司;限制性內切酶、T4連接酶購自MBI公司;質粒抽提試劑盒購自OMEGA公司;RPMI 1640培養液、Opti-MEM培養液、LipofectamineTM2000脂質體、新生牛血清購自Invitrogen公司;HBsAg ELISA診斷試劑盒購自上?？迫A生物技術有限公司。HepG2細胞株由本實驗室保存。

1.2 載體的構建

按照圖1A示意圖構建重組質粒，步驟如下:以pCMV-HBsAg作為模板、HBs-f和HBs-r為上下游引物進行PCR，擴增產物經XhoⅠ與EcoRⅠ雙酶切獲得HBsAg編碼DNA片段，插入pIRES2-EGFP質粒構建pIRES2-EGFP-HBsAg重組質粒，以PCR法、酶切進行鑒定，陽性克隆進行DNA測序鑒定。獲取BALB/c小鼠骨骼肌組織，加3 ml Lysis Buffer后用勻漿器將組織磨碎，按總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄后以Ub-f和Ub-r為引物進行PCR擴增小鼠泛素編碼基因，純化PCR產物并經NheⅠ與XhoⅠ雙酶切后插入pIRES2-EGFP-HBsAg質粒構建Ub-HBsAg融合表達質粒，以PCR法、酶切法進行鑒定，陽性克隆進行DNA測序鑒定。

1.3 轉染HepG2細胞

將處于對數生長期的HepG2細胞轉種細胞培養皿，待細胞融合度達到70%時進行細胞轉染。設3組、每組2塊細胞培養皿:(1)pIRES2-EGFP-HBsAg質粒單獨轉染組，(2)pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg質粒單獨轉染組，(3)pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg和pIRES2-EGFP-p62共轉染組。將pIRES2-EGFP-HBsAg重組質粒(36 μg)、pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg 重組質粒(36 μg)以及 pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg重組質粒(36 μg)和pIRES2-EGFP-p62重組質粒(18 μg)的混合液分別溶于3個盛有3 ml Opti-MEM的離心管中，再分別向3個離心管中加入已經室溫孵育5 min的LipofectamineTM2000脂質體的Opti-MEM稀釋液3.06 ml，混勻后室溫放置20 min。按前述分組分別向每個培養皿中滴加3.33 ml質粒-脂質體混合液，混勻后置37℃、5%CO2細胞培養箱中，約6 h后換成正常培養基培養24 h。

1.4 對HepG2細胞DRibbles中HBsAg含量的檢測

轉染24 h后分別更換2種不同的細胞培養液:正常培養基和含萬珂 (100 μmol·L－1)、雷帕霉素(10 μmol·L－1)、氯化銨(2 mmol·L－1)培養液，繼續培養16 h后收集細胞培養液并提取DRibbles［1］。采用常規ELISA法檢測各組DRibbles中HBsAg水平。

2 結 果

2.1 pIRES2-EGFP-HBsAg 和 pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg重組質粒的構建與鑒定

采用PCR法從pCMV-HBsAg質粒上擴增HBsAg基因編碼片段，電泳結果顯示PCR產物大約為700 bp，與理論值吻合(圖1B)。采用RT-PCR法從BALB/c小鼠骨骼肌細胞中擴增小鼠泛素蛋白編碼基因，電泳結果顯示PCR產物大約為250 bp，與理論值吻合(圖1C)。

采用 XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切法鑒定 pIRES2-EGFP-HBsAg重組質粒，電泳結果顯示，酶切產物大約為680 bp，與理論值相符(圖1D);采用 NheⅠ、EcoRⅠ對pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg重組質粒進行雙酶切法鑒定，酶切產物位于910 bp位置，與理論值相符(圖1E)。對 pIRES2-EGFP-HBsAg和 pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg質粒分別進行DNA測序，結果顯示HBsAg和Ub-HBsAg編碼基因序列正確、讀碼框架準確(圖1F、G)。

2.2 細胞轉染及其表達的鑒定

熒光顯微鏡觀察轉染細胞發現，3組轉染細胞均可見綠色熒光，轉染率大約為15%(圖2)，各組間無明顯差異。提示轉染細胞能表達靶蛋白，相同的轉染率為后續組間比較DRibbles中HBsAg含量奠定了基礎。

圖1 pIRES2-EGFP-HBsAg和pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg重組質粒的構建與鑒定Fig 1 Construction of HBsAg and Ub-HBsAg expressing vectors

圖2 熒光顯微鏡觀察轉染細胞 ×200Fig 2 Fluorescence images of transfected HepG2 cells ×200

2.3 DRibbles中HBsAg含量的檢測

轉染24 h后，3組轉染細胞分別更換正常培養液和含萬珂(100 μmol·L－1)、雷帕霉素(10 μmol·L－1)以及氯化銨(2 mmol·L－1)的培養液，繼續16 h后提取細胞培養上清中的DRibbles，然后采用ELISA法檢測HBsAg的含量。結果顯示，pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg單獨轉染細胞 DRibbles中HBsAg含量明顯低于pIRES2-EGFP-HBsAg單獨轉染細胞DRibbles，萬珂、雷帕霉素和氯化銨處理pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg轉染細胞后，DRibbles中HBsAg顯著增高。提取Ub-HBsAg和p62表達質粒共轉染HepG2細胞的DRibbles，檢測發現:其中HBsAg含量與pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg轉染細胞沒有明顯差異，但經藥物處理后DRibbles中HBsAg的含量顯著提高，而且明顯高于藥物處理的pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg單獨轉染組。提示蛋白酶體阻斷劑(萬珂)能阻斷蛋白酶體對泛素化蛋白(HBsAg)的降解，過表達p62能提高自噬小體中泛素化蛋白(Ub-HBsAg)的含量。見圖3。

圖3 對HepG2細胞DRibbles中HBsAg含量的檢測Fig 3 Test of HBsAg in DRibbles extracted from HepG2 cell line

3 討 論

根據細胞內降解時間的長短，可將腫瘤細胞產生的蛋白分為長壽蛋白(long-lived proteins)和短壽蛋白(short-lived proteins)兩大類［3－8］。長壽蛋白為細胞內穩定蛋白，其平均半衰期達3 000 min，占總蛋白的70%，其主要通過自噬等途徑被降解成游離氨基酸，進入新蛋白的合成循環或以外排體(exosome)形式排出胞外［7－8］;短壽蛋白的平均半衰期僅為 10 min，約占總蛋白的30%，主要為一些錯誤編碼、錯誤翻譯等產生的DRips以及某些天然短壽的非結構蛋白(short-lived proteins，SLiPs)等［5，9－12］，短壽蛋白的降解主要通過泛素-蛋白酶體(ubiquitin-proteasome)途徑。

抗原交叉提呈在腫瘤免疫、腫瘤疫苗設計等方面具有重要作用［13］。我們前期研究證實，提取含有短壽蛋白的腫瘤細胞自噬小體DRibbles作為腫瘤抗原的有效載體，可被DC等APC細胞攝取加工，通過交叉提呈的方式誘導免疫應答［14－15］。但如何更多地募集腫瘤細胞的短壽蛋白或泛素化蛋白以及如何優化DRibbles腫瘤疫苗有待進一步研究。

p62作為支架蛋白在多種信號傳導途徑中發揮作用，包含PB1結構域、鋅指結構域(zinc finger，Zinc)、TBS結構域(TRAF6 binding site)、LIR結構域(LC3-interacting region，LIR)和泛素相關結構域(ubiquitin-associated domains，UBA)等5 個結構域(圖 4)［16］，近來研究［17－18］發現，p62 蛋白通過 LIR 與 UBA 分別與自噬小體的跨膜蛋白LC3和泛素化蛋白的泛素結合，被認為在兩種蛋白降解途徑(蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑)之間發揮著重要的橋梁作用［2］。p62通過“泛素-p62-LC3-自噬小體途徑”參與了泛素化蛋白的細胞自噬降解，腫瘤細胞(作為抗原供者細胞)內“泛素-p62-LC3-自噬小體途徑”是否影響自噬小體內泛素化蛋白的含量尚不清楚，能否利用p62分子機制優化DRbbles中腫瘤抗原，以促進交叉提呈也有待深入研究。

圖4 p62功能及其結構域示意圖Fig 4 Domain organization of p62

已知，原發性肝癌與HBV感染密切相關，且尚未發現人肝癌細胞的特異性抗原。以HBsAg為模式抗原，將為探討“p62能否增加肝癌細胞DRibbles中腫瘤抗原含量”起到示范和標記作用，為此，本實驗分別建立表達“HBsAg”和“短壽HBsAg”的肝癌細胞模型。實驗結果顯示，從表達Ub-HBsAg轉染細胞中提取DRibbles，其中HBsAg含量很低(圖3)。萬珂是一種蛋白酶體抑制劑，可以抑制蛋白酶體對泛素化蛋白的降解。細胞經萬珂作用后蛋白酶體被抑制，泛素化的蛋白不能經蛋白酶體途徑降解，變成了“長壽蛋白”而由自噬途徑在溶酶體中降解。雷帕霉素是自噬誘導劑，氯化銨可提高溶酶體中的pH值，抑制溶酶體活性，自噬小體無法在溶酶體中降解，轉而被排出胞外成為DRibbles。加入萬珂、雷帕霉素和氯化銨處理轉染細胞，結果顯示，pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg轉染細胞DRibbles中HBsAg含量顯著增高，提示蛋白酶體抑制劑成功阻斷了蛋白酶體對Ub-HBsAg的降解。

隨后將pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg和pIRES2-EGFP-p62共轉染HepG2細胞，提取DRibbles并檢測HB-sAg發現，與pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg單獨轉染細胞一樣，DRibbles中 HBsAg含量都處于較低水平，提示Ub-HBsAg主要通過蛋白酶體途徑降解，即使過表達的p62也不會募集到更多的泛素化蛋白;但經藥物處理后，DRibbles中 HBsAg顯著增高并明顯高于pIRES2-EGFP-Ub-HBsAg單獨轉染細胞，提示當泛素化蛋白通過自噬途徑降解時，p62蛋白能將更多的Ub-HBsAg募集到自噬小體中。

總之，阻斷蛋白酶體途徑降解，p62能將更多的短壽蛋白募集到DRibbles中，這為提高DRibbles疫苗中的抗原含量提供了新的技術途徑。

［1］LI Y，WANG L X，YANG G，et al.Efficient cross-presentation depends on autophagy in tumor cells［J］.Cancer Res，2008，68(17):6889-6895.

［2］MOSCAT J，DIAZ-MECO M T.p62 at the crossroads of autophagy，apoptosis，and cancer ［J］.Cell，2009，137(6):1001-1004.

［3］YEWDELL J W，ANTON L C，BENNINK J R.Defective ribosomal products(DRiPs):a major source of antigenic peptides for MHC class I molecules?［J］.J Immunol，1996，157(5):1823-1826.

［4］SCHUBERT U，ANTON L C，GIBBS J，et al.Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes［J］.Nature，2000，404(6779):770-774.

［5］YEWDELL J W.Immunology.Hide and seek in the peptidome［J］.Science，2003，301(5638):1334-1335.

［6］YEWDELL J W.Plumbing the sources of endogenous MHC class Ⅰ peptide ligands［J］.Curr Opin Immunol，2007，19(1):79-86.

［7］KOMATSU M，WAGURI S，CHIBA T，et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice［J］.Nature，2006，441(7095):880-884.

［8］HARA T，NAKAMURA K，MATSUI M，et al.Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice［J］.Nature，2006，441(7095):885-889.

［9］PRINCIOTTA M F，FINZI D，QIAN S B，et al.Quantitating protein synthesis，degradation，and endogenous antigen processing［J］.Immunity，2003，18(3):343-354.

［10］YEWDELL J.To DRiP or not to DRiP:generating peptide ligands for MHC classⅠmolecules from biosynthesized proteins［J］.Mol Immunol，2002，39(3-4):139-146.

［11］YEWDELL J W，NICCHITTA C V.The DRiP hypothesis decennial:support，controversy，refinement and extension［J］.Trends Immunol，2006，27(8):368-373.

［12］QIAN S B，PRINCIOTTA M F，BENNINK J R，et al.Characterization of rapidly degraded polypeptides in mammalian cells reveals a novel layer of nascent protein quality control［J］.J Biol Chem，2006，281(1):392-400.

［13］VYAS J M，van der VEEN A G，PLOEGH H L.The known unknowns of antigen processing and presentation［J］.Nat Rev Immunol，2008，8(8):607-618.

［14］LI Y，WANG L X，PANG P，et al.Cross-presentation of tumor associated antigens through tumor-derived autophagosomes［J］.Autophagy，2009，5(4):576-577.

［15］WANG L X，LI R，YANG G，et al.Interleukin-7-dependent expansion and persistence of melanoma-specific T cells in lymphodepleted mice lead to tumor regression and editing［J］.Cancer Res，2005，65(22):10569-10577.

［16］MATHEW R，KARP C M，BEAUDOIN B，et al.Autophagy suppresses tumorigenesis through elimination of p62 ［J］.Cell，2009，137(6):1062-1075.

［17］丁磊，曹萌，王立新.細胞自噬參與蛋白降解及抗原遞呈的研究進展［J］.國際免疫學雜志，2009，32(3):180-183.

［18］ICHIMURA Y，KOMINAMI E，TANAKA K，et al.Selective turnover of p62/A170/SQSTM1 by autophagy［J］.Autophagy，2008，4(8):1063-1066.