抗顫寧方對PD大鼠脂質過氧化及多巴胺能神經元的影響1)

張希廉,田軍彪

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD雌性大鼠(許可證號:SCXK冀2003-1-003)60只,體重(200±20)g,由河北醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要實驗儀器 SR-6N型大鼠腦立體定位儀(日本),BP211D型微量天平(中國),LDZ5-2型低速自動平衡離心機(中國),5 μ L微量進樣器(上海),OLYMPUS CH2O型顯微鏡(德國),Leica RM2245型石蠟切片機(德國),圖像分析系統(美國)。

1.3 主要藥物和試劑 美多巴:瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏有限公司;6-OHDA、阿撲嗎啡(APO):Sigma公司;中藥抗顫寧8劑:河北醫科大學中醫院制劑室制備;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NO測試盒:南京建成生物工程研究所;一抗T H抗體(1∶100):美國SANTA CRUZ 公司;二抗IgG(1∶200):河北博海生物工程有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 中藥煎取 龜板15 g,白芍20 g,黃芪15 g,當歸12 g,雞血藤15 g,天麻15 g,川樸15 g,云苓 12 g,川芎 6 g,炙甘草9 g,水煎2次,將兩煎液混合濃縮成每 1 mL含生藥3.35 g的水煎液,分裝,密封,冷藏保存。

1.4.2 動物分組 全部大鼠均進行行為檢測,確認無震顫、運動減少、肢體僵硬、豎毛、豎尾等行為后,每籠5只喂養(室溫 22℃,濕度45%)。1周后隨機選出8只作為假手術組;其余造模,造模成功大鼠根據隨機數字表隨機分成模型組、中藥組、西藥組各8只。

1.4.3 模型制備 取SD大鼠,用10%水合氯醛給予大鼠腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,剪去頭部頭發,在常規消毒下,于頭顱正中切開頭皮和皮下組織,確定前囟坐標,參照文獻[1]大鼠腦立體定位圖譜,確定右側黑質兩坐標為:①前囟尾側4.4 mm,矢狀縫右側1.2 mm,硬膜下7.8 mm;②前囟尾側4.8 mm,矢狀縫右側1.0 mm,硬膜下7.8 mm。計算出注射點的相對坐標,進行標記定位后,牙科鉆在相應部位鉆透顱骨,勿損傷硬腦膜。用5 μ L微量進樣器吸取6-OHDA 4μL(濃度為4 μ g/μL),每孔 2 μ L,緩 慢進針至預定深度,以 1 μ L/min 的速度注入,注射完畢后留針10 min,以1 mm/min的速度緩慢退出,縫合皮膚。術后前3 d腹腔注射青霉素鈉2×105U,以預防感染。

1.4.4 行為學檢測 術后第14天進行行為學檢測,給受試大鼠腹腔注射APO 0.5 mg/kg,以誘發大鼠向左側單向旋轉,并記錄旋轉開始時間、結束時間和旋轉圈數。若大鼠恒定轉向左側(圈數不限),視為模型制作成功大鼠。

1.4.5 給藥方法 中藥組大鼠灌服抗顫寧方,西藥組大鼠灌服美多巴,用藥量分別為:33.5 g/kg、125 mg/kg,分別相當于按人和動物每千克體重劑量的15倍、30倍[2];模型組大鼠給予等體積的蒸餾水。于術后第15天給藥,每日劑量于16:00～17:00 1次灌胃,均灌胃 14 d。

1.4.6 測定抗氧化酶及脂質過氧化改變 末次灌胃后次日將大鼠用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉后打開腹腔,充分暴露心臟,用5 mL注射器針頭刺進左心室,取不抗凝全血3 mL,靜置20min后用低速離心機3000r/min離心15min后取血清,-37℃冰箱保存,以比色法分別測定血清中SOD的活性、MDA含量及NO含量。

1.4.7 酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學染色 取血后依次經左心室從升主動脈灌注約200 mL生理鹽水,同時剪開右心耳,隨后再灌注4%多聚甲醛作內固定,而后斷頭取腦浸泡于4%多聚甲醛溶液中放4℃冰箱固定24 h,然后用PBS漂洗30 min,每分鐘3次,梯度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋。作石蠟連續冠狀切片,片厚 5μ m,切片直接貼覆于明膠包被的載玻片上,每塊組織間隔選取4張切片,將切片脫蠟,用0.01 mol/L PBS沖洗后,用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的4%多聚甲醛室溫固定30 min,然后按SABC法作TH免疫組織化學染色,200倍相差顯微鏡下隨機取5個4 mm2的視野,用圖像分析系統分別累計右側黑質的TH陽性神經元數目并計算其均數。

1.5 統計學處理 采用SAS統計軟件對數據進行t檢驗或完全隨機的單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠治療后SOD、MDA和NO變化(見表1) 模型組與西藥組大鼠SOD活性均較假手術組明顯下降(P＜0.01),中藥組大鼠SOD活性與假手術組比較無統計學意義(P＞0.05);模型組大鼠 MDA、NO含量與假手術組、中藥組、西藥組比較均明顯升高(P＜0.05),而中藥組與西藥組大鼠MDA、NO含量與假手術組比較無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠給藥后SOD、M DA和NO變化(±s)

表1 各組大鼠給藥后SOD、M DA和NO變化(±s)

組別 SOD(U/mL) M DA(μ mol/L) NO(μ mol/L)假手術組 148.592±17.000 22.725±7.005 25.778±14.389模型組 108.298±16.0302) 33.151±7.7091) 79.776±22.0761)西藥組 118.612±15.4322) 22.377±3.1903) 49.778±25.2343)中藥組 144.620±6.4014) 22.275±2.3413) 32.446±15.0603)與假手術組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05;與西藥組比較,4)P＜0.05

2.2 各組大鼠右側黑質的T H陽性細胞計數(見表2) 假手術組、中藥組、西藥組大鼠右側黑質的TH陽性細胞計數均多于模型組(P＜0.01);中藥組大鼠右側黑質的T H陽性細胞計數亦多于西藥組(P＜0.05);假手術組大鼠右側黑質的TH陽性細胞計數多于西藥組(P＜0.01);中藥組大鼠右側黑質的TH陽性細胞計數與假手術組無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠右側黑質T H陽性細胞計數(±s)

表2 各組大鼠右側黑質T H陽性細胞計數(±s)

組別 視野 右側黑質假手術組 20 42.000±15.3791)模型組 20 5.160±6.598中藥組 20 33.200±11.3891)西藥組 20 17.600±4.3931)3)與模型組比較,1)P＜0.01;中藥組與西藥組比較,2)P＜0.05;西藥組與假手術組比較,3)P＜0.01

2.3 各組右側黑質的TH陽性細胞結果 在假手術組右側黑質可見密集的TH陽性細胞,呈棕褐色,這些細胞體主要為圓形或卵圓形,少數為多邊形,有些細胞分枝狀樹突、單根或成束的軸突清晰可見[3]。而模型組右側黑質可見少量、稀疏的TH陽性細胞,呈棕褐色,細胞計數為假手術組右側黑質的12.29%(5.16/42);而中藥組黑質可見較密集的TH陽性細胞,呈棕褐色,細胞體亦主要為圓形或卵圓形,少數為多邊形,細胞計數為假手術組右側黑質的79.05%(33.2/42);西藥組亦可見密集的T H陽性細胞,呈棕褐色,細胞體亦主要為圓形或卵圓形,少數為多邊形,細胞計數為假手術組右側黑質的41.91%(17.6/42)。

3 討 論

3.1 脂質過氧化 現代研究認為,6-OHDA通過和多巴胺競爭,可與高親和力的多巴胺轉運體結合進入黑質紋狀體多巴胺能神經元,并迅速被分子氧氧化形成 H2O2、超氧化物和醌,生成的大量活性氧自由基和氫氧自由基[4]超出了多巴胺能神經元自身抗氧化清除自由基的能力,使生物膜中的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應,產生一系列的脂質過氧化物,其中MDA毒性最強,發揮神經毒性作用,導致黑質紋狀體多巴胺能神經元死亡。另外,6-OHDA還有抑制線粒體呼吸鏈的功能,誘發細胞凋亡等方面機制而發揮神經毒性作用。本實驗結果表明:抗顫寧方在增加SOD的活性方面優于美多巴,而在減低MDA含量方面與美多巴無差別;SOD活性的降低使得自由基的產生過多,自由基的增加使得不飽和脂肪酸水平降低,其代謝產物MDA在體內增加,這是基于脂質過氧化反應增強的結果。有研究表明[5]:在PD的早期,黑質紋狀體多巴胺能神經元中的SOD活性增強,這是自由基產生增多時機體的一種代償性反應;隨著病情的加重,氧化和抗氧化的平衡關系被打破,導致細胞的受損和死亡。

3.2 NO的神經毒性作用 NO是一種具有自由基性質的生物活性分子,在體內有生物信使作用,但過量的NO還表現出神經毒性[6]。NO和過氧化物反應產生的過亞硝酸鹽能降低黑質紋狀體通路中細胞的抗氧化能力,導致多巴胺能神經元死亡;另外,NO還會引起許多蛋白的亞硝基化,抑制磷酸化和糖酵解通路;也可通過損害DNA導致二磷酸腺苷核糖多聚酶過度活化引起神經細胞三磷酸腺苷衰竭和死亡發揮神經毒性作用[7]。本實驗結果表明抗顫寧方可降低血清中NO的含量。

3.3 T H免疫組織化學 由于黑質致密部呈斜扁柱狀,體積狹小,在冠狀面上最長垂直距離不足0.5 mm。TH作為DA能神經元的標志物具有特異性[8],故TH免疫組織化學方法常被用于顯示DA能神經元細胞體及其突起。本研究應用TH免疫組織化學方法清晰地顯示了神經元細胞體及突起。實驗結果表明中藥和西藥均能保護多巴胺能神經元免受損害,但中藥療效優于西藥。

3.4 帕金森病的中西醫治療概況 帕金森病(PD)是臨床上較為常見的神經系統退行性疾病之一,具有特征性的臨床表現和病理學特點。目前對于帕金森病的治療常采用多巴胺類制劑,但這些藥物不能阻止病情的進展,且隨著病情發展,用藥量會逐漸增大,許多病人會出現嚴重的并發癥及副反應,而且病情晚期會出現種種非多巴胺能的非運動障礙癥狀,現有的多巴胺能或非多巴胺能藥物幾乎對這些癥狀無效。手術治療亦有其局限性,細胞移植及基因治療有望治愈帕金森病,但仍處于試驗研究階段[9]。

祖國醫學治療帕金森病具有獨特的特點和優點,中醫藥從整體辯證著眼,標本兼治,通過調節機體整體狀況,提高生存質量而起作用;與西醫藥相比,中醫藥具有適應性廣、不良反應小、遠期療效較好且不易產生耐受性等優點;另外,很多研究者對服用美多巴產生的運動波動癥進行觀察發現,中藥可減少劑末少動及開關現象的發生,并可延長開期時間[10]。但是諸家對帕金森病的辨證和治療存在分歧,說明中醫、中西醫結合對帕金森病的認識尚處于較淺的層面;另外,目前國際上已有大量文獻探討帕金森病的非運動障礙癥狀的問題;中醫文獻中還很少有關中藥治療帕金森病非運動癥狀的報道。帕金森病病因繁多,病機復雜。古代醫家對此病多從肝、從腎、從風方面治療。現代醫家對本病的治療用藥也進行了大量的研究[11,12]。

通過長期臨床觀察認為帕金森病主要病變部位在腦,主要病機是由于肝腎陰虛,虛風內動,損傷腦絡,神機受損,筋脈肢體失控,加之久病入絡,耗氣傷血,致氣血虧虛,筋脈失養,而發肢體震顫、肌肉僵直、運動遲緩。創制了滋補肝腎、益氣養血、熄風止顫中藥抗顫寧方;方中龜板、天麻為君藥,黃芪、當歸為臣藥,白芍、雞血藤、川芎、川樸、云苓為佐藥,炙甘草為佐使藥。帕金森病早期可單獨應用中醫藥,推遲多巴胺類制劑的使用時間;帕金森中晚期使用多巴胺類制劑且同時應用中醫藥,可減少多巴胺類制劑的用量,減輕西藥的不良反應,從而延長多巴胺類制劑的使用時間,并可在一定程度上解決西藥的不良反應及對藥物的耐受性而不能堅持服藥的問題。本實驗結果[13]表明抗顫寧方治療帕金森病的可能機制在于:一是改善整體和局部腦組織的氧化應激狀態,減少自由基對多巴胺能神經元的氧化損害;二是可能通過抑制NO的神經毒性起作用;三是可能通過保護DA能神經元免受損害而相對增加其數量起作用。

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[13] 張希廉,田軍彪.抗顫寧方對帕金森病大鼠行為學及脂質過氧化的影響[J].河北中醫雜志,2009,31(3):441-443.