側腦室注射STZ對大鼠學習記憶障礙及海馬tau蛋白AD特異性位點磷酸化增加的影響

第五永長,辛馥伶,李 敏,趙 娜,苗迎春,時 晶

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性記憶認知損害和智能障礙為主的中樞神經系統退行性疾病。目前公認的AD核心病理特征為大腦局部,尤其是海馬和皮層神經元退行性病變,細胞內神經原纖維纏結(NFT)和細胞外老年斑(SP)沉積。然而,AD的病因和確切發病機制目前仍不清楚。葡萄糖代謝紊亂和能量生成減少與淀粉樣蛋白沉積以及tau蛋白過度磷酸化密切相關,可能促進了AD的發生。鏈脲佐菌表(STZ)側腦室注射已被證實可以引起大鼠腦持久的葡萄糖代謝紊亂、能量生成障礙伴海馬乙酰膽堿轉移酶活性降低和氧化應激反應以及學習記憶障礙[1],然而其與AD病理改變的聯系未得到進一步實驗證實。本實驗進一步觀察了STZ側腦室注射對大鼠學習記憶及海馬組織tau蛋白AD特異性磷酸化位點Ser422的磷酸化程度的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,體重(250±20)g。隨機分成假手術組、STZ側腦室注射模型組,每組18只。實驗過程中動物自由攝食和飲水(術前禁食除外),室溫22℃ ～ 26℃,濕度為28%～30%。

1.2 藥品與試劑 鏈脲佐菌素:Sigma公司;抗體:pS214(western blot檢測及免疫組化檢測的一抗分別購自Biosource和Abcam公司)。

1.3 ICV-STZ擬 AD模型制備 參考 Sharma等[2]方法,所有大鼠經10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后,固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀上,常規消毒皮膚,正中矢狀切口,分離骨膜,錐顱器鉆開顱骨,暴露硬腦膜。除假手術組外,其余動物均用微量注射器每側側腦室各注射 STZ約 18 μ L(3 mg/kg,注射前將STZ溶于人工腦脊液,濃度為25 mg/mL)。坐標參考《大鼠腦立體定向圖譜》[3]:前囟后1.5 mm,矢狀縫左右旁開1.5 mm,腦表面下3.5 mm。第3天重復注射,劑量同前。假手術組以等量人工腦脊液替代STZ。術后常規飼養21 d后行為學測試并處理第一批,31 d后行為學測試并處理第二批動物。

1.4 學習記憶能力測試 采用Morris水迷宮試驗法。

1.5 腦組織樣品處理 于行為學測試完畢后,分別于、兩個時間點選取動物,灌注固定,按4 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。迅速插導管于左心室至升主動脈并固定,同時剪開右心耳。快速灌注生理鹽水100 mL至肝臟完全變白,右心室流出澄清液體后,更換4%多聚甲醛先快后慢繼續灌注30 min,然后斷頭,完整取出鼠腦,置固定液中,24 h后石蠟包埋切片。每只大鼠海馬CA1區出現后連續冠狀切片,放入0.01 mol/L PBST的溶液中進行免疫組化染色。

Western-blot蛋白印跡檢測取用新鮮腦組織置液氮中速凍后保存于-70℃冰箱。

2 結 果

2.1 行為學測試結果(見表1、表2)

表1 造模21 d后兩組定位航行試驗結果(±s)

表1 造模21 d后兩組定位航行試驗結果(±s)

組別 n 平均逃避潛伏期(s)第21天 第22天 第23天游泳距離(cm)第21天 第22天 第23天假手術組 6 57.82±9.86 40.36±13.06 19.49±11.98 703.15±191.96 521.56±218.58 86.21±139.44模型組 9 107.23±14.961) 96.14±25.261) 79.26±18.161) 1 261.83±314.351)1 039.38±229.341)756.38±196.551)與假手術組比較,1)P＜0.01

表2 造模31 d后兩組定位航行試驗結果(±s)

表2 造模31 d后兩組定位航行試驗結果(±s)

組別 n 平均逃避潛伏期(s)第31天 第32天 第33天游泳距離(cm)第31天 第32天 第33天假手術組 6 86.93±17.98 54.90±19.39 19.77±12.87 814.72±135.22 589.20±214.47 234.55±134.94模型組 8 113.95±17.221) 103.05±24.901) 67.23±14.551) 853.36±168.201) 830.42±256.291) 619.84±148.411)與假手術組比較,1)P＜0.01

2.2 免疫組化檢測結果(見表3)

表3 造模第21天、第31天后大鼠海馬CA1區tau-ps422表達(±s)

表3 造模第21天、第31天后大鼠海馬CA1區tau-ps422表達(±s)

組別 第21天后陽性目標平均數 陽性目標總面積 陽性目標平均灰度值第31天后陽性目標平均數 陽性目標總面積 陽性目標平均灰度值假手術組 2.61±0.12 16.19±2.03 8.40±3.11 4.01±1.05 19.87±4.12 13.85±4.16模型組 11.36±2.911) 30.61±3.252) 20.72±3.862) 20.58±4.121) 51.36±5.112) 38.62±5.282)與假手術組比較,1)P＜0.01,2)P＜0.05

2.3 Western blot檢測結果(見表4)

表4 造模第31天后大鼠海馬區 tau-ps422表達(±s)

表4 造模第31天后大鼠海馬區 tau-ps422表達(±s)

組別 tau-ps422假手術組 6.81±1.98模型組 23.96±3.281)與假手術組比較,1)P＜0.01

3 討 論

STZ是一種甲基亞硝基脲產物,具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副反應。1996年Hoyer帶領的研究小組首次用側腦室注射STZ的方法來干擾胰島素/受體(Ins/IR)信號系統,使腦內出現漸進性葡萄糖和糖原合成減少[4]。而有實驗證明Ins/IR信號轉導系統障礙是引起AD腦內葡萄糖/能量代謝異常的主要原因[5],在此基礎上形成糖基化終末產物(AGEs),并最終導致Aβ及NFT的形成[6]。2005年美國布朗醫學院的dela Monte教授和她的研究小組驗證了AD是“3型糖尿病”的假說。通過對尸檢腦組織進行檢測,發現AD患者腦內胰島素、IGF及其受體的蛋白含量和基因表達均較對照組明顯降低;2006年該小組通過對小鼠側腦室注射STZ的方法阻斷胰島素受體自身磷酸化和內在的酪氨酸激酶活性[7],損傷胰島素和IGF信號轉導通路,實驗發現,微量的STZ未引起外周血糖升高,胰腺結構和胰島素的免疫活性也沒受到影響;卻出現腦體積縮小,細胞丟失、神經膠質增生、Aβ沉積增多、tau蛋白過度磷酸化、泛素化等驚人變化,學術界一致認為該模型成功地模擬了SAD的病理特征。目前認為,STZ破壞Ins/IR信號轉導通路,降低了大鼠腦內葡萄糖利用(GU),引起腦能量代謝障礙,ATP、GTP生成減少,造成認知功能相關皮層的神經細胞功能受損,影響突觸傳遞和突觸可塑性,導致學習記憶功能障礙,這也是引起基底前腦合成乙酰膽堿減少、氧化應激、軸突和突觸損傷的基礎。近年進一步研究認為,大腦葡萄糖代謝低下可通過改變tau的O-GlcNAc糖基化修飾調節tau的磷酸化,在AD發病機制中起著重要作用。與腦葡萄糖能量代謝障礙同時存在的葡萄糖轉運體GLUT1與GLUT3減少和tau蛋白的O-GlcNAC糖基化水平呈正相關,同時也與tau蛋白的磷酸化水平呈負相關。葡萄糖代謝障礙引起Tau的O-GlcNAC糖基化修飾水平下降,促進了tau的過度磷酸化和AD重要病理改變NFT的形成[8]。

本實驗結果顯示,大鼠側腦室注射STZ后第21天即出現明顯的學習記憶障礙,模型組與假手術組比較有統計學意義(P＜0.01);隨著時間的延長第31天后大鼠的學習記憶障礙不但沒有恢復,而且有進一步加重趨勢(P＜0.01)。同時,造模第21天模型組大鼠海馬CA1區tau-ps422即有陽性表達,而假手術組則不明顯,造模第31天模型組大鼠海馬CA1區 tau-ps422表達更為明顯,而假手術組幾乎沒有陽性表達。Western blot檢測結果顯示:隨著時間的延長,造模第31天模型組大鼠在50 kD～71kD之間條帶(約67kD,為tau-ps422的表達)明顯比假手術組大鼠在這一區域的條帶粗,說明造模第31天模型組大鼠海馬tau蛋白在Ser422位點的磷酸化水平明顯高于假手術組。近幾年對于tau蛋白磷酸化位點的研究表明,Ser422位點是AD特異性位點,其磷酸化使tau變成毒性分子從而拮抗正常微管相關蛋白的作用[9],Thr231,Ser396和 Ser422的進一步磷酸化則可促使tau自身聚積成纖維狀結構。Tau羧基端(Ser396,Ser404,Ser422)的磷酸化對其形成雙股螺旋絲(PHF)起關鍵作用[10-12]。

STZ側腦室注射可引起大鼠學習記憶障礙及海馬組織tau蛋白AD特異性磷酸化位點Ser422的磷酸化水平增加,這對于進一步形成PHF/NFT非常重要,因而是較為理想的散發性AD(SAD)模型,可用于AD的腦能量代謝及tau蛋白磷酸化方面的研究。

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