替米沙坦對大鼠離體胸主動脈環的舒張作用1)

姚 雷,梁月琴,任俊杰,陳 媛,武冬梅,王 君,張軒萍,許慧玉,張 軍

血管緊張素Ⅱ1受體(AT1)拮抗劑(ARBs)是目前國際上推薦的五大類降壓藥中作為降壓治療的一線藥物之一。在國內應用很普遍,它是繼血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)之后的一類作用于腎素-血管緊張素系統(RAS)的重要藥物。替米沙坦作為對AT1親和力最強的ARBs,它選擇性、不可逆轉地拮抗AngⅡ的AT1受體而不影響包括心血管調節的其他受體系統[1]。它可以松弛血管平滑肌,增加鹽類排泄[2]。現有的研究認為,替米沙坦主要是通過拮抗AT1受體而發揮舒張血管的作用,為了研究替米沙坦在舒張血管平滑肌的過程中是否有AT1受體以外的機制參與,本實驗從調節血管張力的角度出發,觀察了替米沙坦對大鼠離體胸主動脈環張力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 替米沙坦:江蘇中邦制藥有限公司,批號20081206;左旋硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME):Sigma公司,批號 511K1351;吲哚美辛(Indomethacin,Indo):Sigma公司,批號 065N7764;去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE):Sigma公司,批號086K1540;其余均為化學試劑國產分析純。BL-420F計算機生物信號采集分析系統(成都泰盟科技有限公司);張力換能器(FT-100,成都泰盟科技有限公司);數字式超級恒溫浴鍋(HH-501,常州國華電器有限公司)。

1.2 實驗動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠,雄性,月齡2個月～3個月,體重250g～300g,由山西醫科大學動物實驗中心提供。動物飼養條件:每籠2只,自由攝食飲水,飼養溫度為20℃～25℃,相對濕度40%～70%。用山西醫科大學動物實驗中心提供的標準塊料飼養。

1.3 標本制備 以斷頭法處死大鼠,迅速打開胸腔,分離胸主動脈,將取下的胸主動脈置入預冷預先通氧、pH值為7.4的生理鹽溶液(PSS)中,成分為:NaCl 144 mmol/L,KCl 5.8 mmol/L,MgCl21.2mmol/L,CaCl22.5mmol/L,Glucose11.1mmol/L,HEPES 5 mmol/L。去除血管周圍的脂肪及結締組織,將動脈剪成2 mm～3 mm的血管環,血管環用兩根不銹鋼微型掛鉤從管腔穿過,水平懸掛在浴管內,下方固定,上方以一細鋼絲連于張力換能器,經BL-420F計算機生物信號采集分析系統記錄血管環的張力變化。浴管內含有通以100%氧、pH值為7.4、37℃的生理鹽溶液,前負荷調為2 g,平衡1 h后開始實驗。每20 min換一次營養液。所有動脈環用60 mmol/L-KCl PSS液2次刺激,收縮穩定后,開始正式實驗。去內皮的實驗,將修剪干凈的胸主動脈環兩端固定,用與血管內徑相適的棉棒從管腔擦過,連續2次。血管環懸掛穩定1 h后,用60 mmol/L KCl HEPES液刺激,達到坪值后加入 Ach(10-5mol/L),舒張幅度不超過收縮幅度的5%時認為內皮去除完全,可開始實驗。

1.4 方法 ①張力平衡后,用NE(1×10-6mol/L)分別預收縮內皮完整和去內皮的血管,達到坪值后,以10 min的間隔累積加入1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L的替米沙坦,對照組加入等容量的生理鹽水,描記張力曲線。②張力平衡后,同樣用NE(1×10-6mol/L)預收縮血管,達到坪值后,加入內皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制劑L-NAME(1×10-4mol/L)、環氧合酶抑制劑Indo(1×10-5mol/L)再次達到坪值后,以10 min的間隔累積加入1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L的替米沙坦,描記張力曲線。③1、2、3號浴管內血管穩定后加入NE10-6mol/L,血管環收縮達坪值后用PSS液洗脫,并平衡1 h,然后用無鈣PSS液連續沖洗3次,并孵浴 3 min,之后在 1、2、3號浴管內分別加入溶劑、替米沙坦 1×10-8mol/L、替米沙坦 1×10-5mol/L,孵浴20 min,然后分別加入NE1×10-6mol/L,可見血管環產生迅速而短暫的收縮,待其舒張并平穩后,向各管內加入CaCl22.5 mmol/L,可見血管環再次收縮并達峰值,描記張力曲線。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件系統進行統計學分析。數據以均數±標準差(±s)表示,采用兩獨立樣本 t檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 替米沙坦對NE預收縮的大鼠離體胸主動脈環的直接舒張作用以及內皮對其作用的影響 替米沙坦對NE(1×10-6mol/L)預收縮的離體胸主動脈環產生濃度依賴性的舒張作用,其logEC50為-7.1±0.7,與溶劑對照組相比,張力變化有統計學意義(P＜0.01)。替米沙坦對NE(1×10-6mol/L)預收縮的去內皮離體胸主動脈環產生濃度依賴性的舒張作用,其logEC50為-6.2±0.3,與內皮完整組相比,張力變化有統計學意義(P＜0.01)。詳見圖1。

圖1 替米沙坦和生理鹽水對 NE預收縮的大鼠胸主動脈環的作用以及替米沙坦對內皮完整和去內皮血管的作用

2.2 阻斷劑對替米沙坦舒血管作用的影響 L-NAME孵浴后,替米沙坦的舒張作用減弱,差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。Indo孵浴后,NE誘發的血管張力變化與無阻斷藥時比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見圖2。

圖2 L-NAME、Indo對替米沙坦在NE預收縮大鼠胸主動脈舒張作用中的影響

2.3 替米沙坦對NE在無鈣液中的縮血管效應的影響 在無鈣PSS液中,分別加入替米沙坦1×10-8mol/L、1×10-5mol/L,孵 浴20min后,加入NE10-6mol/L,血管環產生迅速而短暫的收縮,收縮幅度和溶劑組比較無統計學意義(P＞0.05),待血管環舒張并平穩后,加入CaCl2至2.5 mmol/L,血管環再次收縮,替米沙坦組收縮幅度與溶劑組比較無統計學意義(P＞0.05)。詳見圖3。

圖3 替米沙坦對NE在無鈣液中以及CaCl2中縮血管效應的影響

3 討 論

替米沙坦是一種新型、長效、低毒、高選擇性的二苯四咪唑類AngⅡ1型受體(AT1)拮抗劑[1-3],它通過抑制 AT1,降低總外周血管阻力,增加血管壁的順應性,降低血管僵硬性,從而對心血管系統發揮重要的保護作用[4]。

研究表明替米沙坦可能通過促進ACE22表達及拮抗AngⅡ對ACE22表達的抑制作用這些對AT1的阻斷作用以外的途徑來產生降壓及心血管保護作用[5]。為了研究替米沙坦在舒張血管平滑肌的過程中是否AT1受體以外的機制參與,本實驗主要觀察替米沙坦對大鼠離體胸主動脈環張力的直接舒張作用。

實驗表明,替米沙坦對內皮完整和去內皮血管環均有舒張作用,且去除內皮后,其舒張作用減弱。因此,替米沙坦對血管的舒張作用由兩部分組成,部分作用于內皮的舒張機制,部分直接作用于血管平滑肌。

內皮細胞釋放的血管舒張物質在血管平滑肌張力的調節過程中起重要的作用[6,7],即EDRF/NO、前列腺環素(PGI2)和內皮細胞超極化因子(EDHF)。其中NO是內皮細胞釋放的最重要的舒血管物質,對于血管基礎張力的維持至關重要[6,8]。內皮源性NO釋放受抑制導致內皮相關的血管舒張作用減弱[9]。NO可通過NO-sGC-cGM P途徑,使鳥苷酸環化酶(sGC)激活促使cGMP生成,后者則進一步作用于cGMP依賴性蛋白激酶使Ca2+內流減少,增加Ca2+-ATP酶對Ca2+的攝取,或直接使收縮蛋白去磷酸化舒張血管[10]。eNOS抑制劑 LNAM E處理血管后,發現在NE預收縮的基礎上替米沙坦的舒張血管作用部分被阻斷,提示NO途徑可能參加替米沙坦的舒張血管作用。另一舒血管物質是PGI2是由COX催化花生四烯酸產生的,加入環氧合酶抑制劑Indo后,替米沙坦的舒張血管作用未被阻斷,提示PGI2未參與替米沙坦的舒血管作用。

Ca2+在血管平滑肌收縮中起關鍵作用[11],血管平滑肌收縮所需要的Ca2+源于細胞外內流和細胞內釋放。研究表明,NE在無Ca2+PSS液中引起的短暫收縮是細胞內Ca2+釋放的結果[12],加入CaC12后引起血管平滑肌進一步收縮被認為是細胞外Ca2+內流的結果[13]。本實驗采用無Ca2+液和復Ca2+液的實驗方法,發現高濃度和低濃度的替米沙坦都不能抑制NE在無Ca2+液中所引起的血管平滑肌短暫收縮和復Ca2+后的持久收縮,證明了替米沙坦不通過對血管環外鈣依賴性收縮和內鈣依賴性收縮的影響來發揮舒血管作用。

替米沙坦對NE預收縮的大鼠胸主動脈環具有濃度依賴性的舒張作用,其舒張反應可能有內皮依賴性,與內皮產生的NO有關,與PGI2的合成無關,不通過抑制外鈣內流和內鈣釋放發揮舒張作用。

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