芪紅合劑含藥血清對人外周血內皮祖細胞數量及其功能的影響

馬 華,武麗萍

血管內皮祖細胞(EPCs)是成年個體中與血管新生關系最為緊密的干細胞成分。

本研究擬采用血清藥理學、體外細胞培養、細胞熒光免疫等方法觀察中藥復方芪紅合劑對體外培養的EPCs數量及黏附功能的影響。旨在探討益氣活血化瘀中藥復方芪紅合劑可能的內皮保護作用機制,同時為血管內皮損傷及功能障礙相關性疾病的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性 Wistar大鼠 12只,體重(200±11)g,山西醫科大學實驗動物中心提供;中藥芪紅合劑由黃芪、紅花、大黃等組成,上藥按比例稱取后,煎制濃縮為含生藥1.4 g/mL的合劑,山西醫科大學第二醫院中藥制劑室制備;FITC標記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)、人纖維連接蛋白(HFN),Sigma公司;Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL),Molecular Probe公司;CD133,Ancell公司;CD34,BD公司,血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF),Peprotech公司;淋巴細胞分離液,上海華精生物高科技有限公司;M199培養基,Gibco公司;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料研究所。

1.2 方法

1.2.1 制備含藥血清 取大鼠,隨機分成4組:中藥芪紅合劑組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)、對照組。分別給予7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg的芪紅合劑水煎劑及等容積的生理鹽水灌胃,每日2次,連續7d。最后1次灌藥前禁食不禁水12h,灌藥后2 h,心臟采血,室溫靜置2 h～4 h,待血凝固后,4℃冰箱過夜,3 000/min離心 10 min,提取血清,同組血清混勻,經56℃、30 min滅活處理后,0.22 μ m濾膜過濾除菌,-70℃保存備用。

1.2.2 EPCs的分離、培養 采取10名健康成人志愿者空腹外周血(志愿者排除吸煙、近期外傷、手術史、皮膚潰瘍、糖尿病、心血管疾病等影響EPCs的因素),40 mL肝素抗凝。以2 000/min、1500/min離心5min～10min,重懸細胞于M 199培養基(含 20%胎牛血清,VEGF 10 μ g/L,FGF 2 μ g/L,青霉素 100 kU/L,鏈霉素100 kU/L)中,并接種至培養瓶中培養。置37℃5%CO2孵箱培養5 d后,PBS洗掉非貼壁細胞,換培養液繼續培養至7 d,PBS洗掉非貼壁細胞,收集貼壁細胞。相差倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞生長情況。

1.2.3 EPCs的鑒定 ①細胞表型鑒定消化收集培養7 d的貼壁細胞,調節細胞濃度為1×106/mL。PBS洗滌2次,重懸于500 μ L的PBS中,加入 FITC標記的CD133,PE標記的 CD34,混勻,避光孵育30 min,上流式細胞儀檢測。②細胞熒光鑒定:收集的貼壁細胞與 Dil-acLDL(2.4 μ g/mL)在 37℃孵育 1 h后,2%多聚甲醛固定10 min,PBS漂洗后加入FITC-UEA-I(10 μ g/mL)并于37℃避光孵育 1 h,PBS洗滌。激光共聚焦顯微鏡下觀察,Dil-acLDL和FITC-UEA-I雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPCs。

1.2.4 實驗分組 貼壁細胞隨機分成4組。①對照組:先用不含胎牛血清的 M199培養液培養24 h,然后換含空白血清的M199培養液;②芪紅合劑含藥血清各劑量組(共3組):不含胎牛血清的M199培養液培養24 h后,再分別用含低、中、高劑量含藥血清的條件培養液培養24 h、48 h、72 h。

1.2.5 EPCs計數 將各組處理后的EPCs用0.25%胰蛋白酶消化收集,制備成細胞懸液,接種于24孔培養板,每組設6個復孔和空白對照;用Dil-acLDL和FITC-UEA-I對細胞進行熒光染色,雙染色陽性細胞被認為是正在分化的內皮祖細胞,倒置熒光顯微鏡下計數20個隨機選擇的高倍×200視野EPCs。

1.2.6 EPCs黏附能力檢測 用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞;將細胞懸液收集于離心管中,以800/min～1 000/min離心3 min～5 min,棄上清,加培養液,計數;將同等數目的EPCs鋪在包被有HFN的24孔培養板,在37℃培養30 min,計數貼壁細胞。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行分析,計量資料以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 EPCs的形態學改變 從外周血分離獲得的單個核細胞在倒置顯微鏡下呈圓形,體積較小;2 d后出現成簇現象,可見少量細胞貼壁;4 d后細胞體積變大,形態不規則,細胞數量增多,棄去懸浮細胞,可見少量梭形細胞和細胞集落形成,細胞集落中間為圓形細胞,周邊為梭形細胞,呈放射狀排列。培養過程中,貼壁細胞體積逐漸增大,7 d后長梭形狀的內皮樣細胞明顯增多,并可觀察到梭形細胞首尾相連形成線狀結構。

2.2 EPCs的鑒定 激光共聚焦顯微鏡下觀察發現,DilacLDL陽性細胞顯示紅色熒光,主要集中在胞漿,FITC-UEA-I陽性細胞顯示綠色熒光,主要集中在胞膜。雙染色陽性細胞呈黃色為正在分化的EPCs。流式細胞儀檢測細胞表面標志,結果顯示貼壁細胞表達CD34陽性率為(38.36±3.70)%,CD133陽性率為(13.91±1.47)%。進一步從功能上證實了培養的細胞為EPCs。

2.3 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs數量的影響 低、中劑量芪紅合劑顯著增加EPCs的數量,并且呈時間依賴性增加EPCs的數量,EPCs數量在低劑量芪紅合劑作用后24 h開始高于對照組,于72 h達到高峰;中劑量芪紅合劑作用后48 h開始高于對照組,于72 h達到高峰;高劑量芪紅合劑僅于作用72 h后高于對照組(P＜0.05)。此外,中藥芪紅合劑含藥血清在干預EPCs 48 h、72 h時,EPCs數量呈劑量相關性,低劑量組較中、高劑量組的 EPCs數量明顯增高(P＜0.05)。詳見表1。

表1 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs數量的影響(±s)

表1 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs數量的影響(±s)

組別 n 24 h 48 h 72 h對照組 6 37.5±7.5 44.8±4.9 46.1±3.1含藥血清低劑量組 6 55.0±4.61) 70.5±8.01) 82.7±9.41)含藥血清中劑量組 6 45.3±4.2 57.9±5.71)2) 63.3±6.31)2)含藥血清高劑量組 6 45.5±9.3 41.1±7.1 55.2±4.81)2)3)與對照組比較,1)P＜0.05;與含藥血清低劑量組比較,2)P＜0.05;與含藥血清中劑量組比較,3)P＜0.05

2.4 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs黏附功能的影響低、中劑量芪紅合劑顯著增加EPCs的貼壁細胞數,并且呈時間依賴性增加,低劑量芪紅合劑作用后于24 h貼壁細胞數量開始高于對照組,于72 h達到高峰;中劑量芪紅合劑作用后于48 h貼壁細胞數量開始高于對照組,于72 h達到高峰,高劑量芪紅合劑僅于作用72 h后高于對照組(P＜0.05)。此外,中藥芪紅合劑含藥血清在干預48 h、72 h時,EPCs的貼壁數量呈一定的劑量相關性,低劑量組較中、高劑量組的數量明顯增高(P＜0.05)。詳見表2。

表2 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs黏附功能的影響(±s)

表2 芪紅合劑含藥血清對人外周血EPCs黏附功能的影響(±s)

組別 n 24 h 48 h 72 h對照組 6 23.8±3.2 25.4±4.2 23.8±5.0含藥血清低劑量組 6 31.3±3.11)40.8±4.31) 48.4±4.41)含藥血清中劑量組 6 21.2±2.5 31.7±3.41)2) 40.4±3.81)2)含藥血清高劑量組 6 21.2±4.2 26.8±3.4 33.0±2.21)2)3)與對照組比較,1)P＜0.05;與含藥血清低劑量組比較,2)P＜0.05;與含藥血清中劑量組比較,3)P＜0.05

3 討 論

血管內皮細胞功能障礙(endothelial cell dysfunction,ED)是多種心腦血管疾病發生的共同病理生理改變,其典型病理生理變化是導致血管痙攣、血管異常收縮、血栓形成及血管增生。在動脈粥樣硬化、心肌缺血、組織缺血、缺氧再灌注損傷等疾病發展中存在著不同程度的內皮損傷[1]。高血壓、高血脂、吸煙、糖尿病、動脈粥樣硬化家族史、高齡、等危險因素都可以造成ED[2-4]。1997年,Asahara等[5]首次分離并證實人類出生后的外周循環血液中,存在能分化成為血管內皮細胞的 EPCs。EPCs在成年機體的血管新生中起重要作用,新生血管中25%的內皮細胞是由EPCs分化而來的。研究顯示,中醫氣虛血瘀證與內皮細胞損傷及其功能障礙之間有密切的聯系,氣虛血瘀可能為血管內皮損傷及功能失調的主要發病機制之一[6]。目前臨床及基礎研究發現,某些益氣活血化瘀類中藥對于冠心病、糖尿病、周圍血管病、手術及創傷多種疾病的內皮細胞的修復有良好的療效,具有一定的內皮細胞保護作用[7,8]。益氣活血類中藥對于內皮細胞的前體細胞EPCs是否有一定的作用,其內皮細胞保護作用機制是否與EPCs途徑有關值得探討。此外,尋找體內動員EPCs或體外促進其向內皮系增殖分化的藥物能夠對治療心腦血管病、周圍血管病變、糖尿病大血管病變、及手術及創傷等內皮損傷、內皮功能障礙及血管新生相關性疾病意義重要。

中藥復方芪紅合劑是臨床治療氣虛血瘀癥的經驗方。由黃芪、紅花、大黃等組成。諸藥配伍,味少力專,共達益氣活血,通脈祛瘀之功。臨床運用芪紅合劑對冠心病、周圍血管病變、糖尿病大血管病變、腦血管病等疾病的防治效果滿意,能有效改善癥狀,延緩病情的進展。實驗過程中,順利完成了體外誘導、增殖和分化人外周血EPCs,用制備的低、中、高劑量中藥芪紅合劑含藥血清干預體外培養的EPCs,進一步觀察了益氣活血化瘀中藥復方芪紅合劑對人外周血EPCs體外數量和功能的影響。運用中藥血清藥理學和體外細胞培養技術相結合的方法進行研究,具有一定的創新性。中藥復方多數是通過口服而起作用,但是中藥粗制劑中含有大量雜質,若直接將中藥粗制劑加入體外反應體系進行實驗,其滲透性、pH值、蹂質、無機鹽等許多非特異性理化因素將嚴重干擾實驗結果,因而其實驗結果的可靠性和科學性難以得到認可[9]。中藥粗制劑經口服吸收后,再用含藥血清進行體外實驗,不僅能反映藥物中可吸收部分的直接作用,也可反映藥物在機體作用下形成的代謝產物和藥物誘生的內源性生成物的間接結果,真實反映藥物在體內的藥理作用,使體外試驗能較好地重復在體試驗的結果。

本實驗采用低、中、高不同劑量的芪紅合劑含藥血清對EPCs進行干預研究,結果顯示,芪紅合劑可以增加EPCs的數量,并能改善EPCs的黏附功能,其影響呈一定的量效、時效關系。芪紅合劑對EPCs數量及黏附功能的影響隨劑量增高而有所降低,而在同一劑量組中,芪紅合劑對EPCs數量及黏附功能的影響于24 h作用明顯,于72 h達到高峰。提示中藥芪紅合劑可能具有一定的動員自體EPCs數量和黏附功能的作用,其具體的作用途徑有待進一步探討。

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