高糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及HGFmRNA表達(dá)作用的影響

范蓮芝,孫喜明,王桂英,孟德雁

糖尿病以慢性高血糖為主要共同特征。高血糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是形成動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因之一。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是由間質(zhì)來(lái)源細(xì)胞分泌的多效性生長(zhǎng)因子,具有促進(jìn)多種類型的細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成的作用[1]。本文研究了不同作用時(shí)間高糖對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC304)增殖及HGFmRNA表達(dá)的影響,探討糖尿病患者高血糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的原因。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器 RPMI1640(Gibco),胎牛血清(杭州四季青),Trizol(上海生工),RT-PCR試劑盒(大連寶生物),PCR儀(PTC100型),電泳儀(型號(hào)PS3000),紫外凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVP型號(hào)GDS7500),其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC304,南京凱基生物工程有限公司提供)。EC304細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中,置37℃含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育,待長(zhǎng)致瓶底的60%～80%,用0.05%的胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 M TT法分析高糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24 h后,改用無(wú)血清培養(yǎng)液孵育24 h,使細(xì)胞處于相對(duì)靜止期后按下列方法分為4組。對(duì)照組,培養(yǎng)液含D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L。15 mmol/L組,培養(yǎng)液 D-葡萄糖濃度為15 mmol/L。25mmol/L組:培養(yǎng)液D-葡萄糖濃度為25mmol/L。35mmol/L組,培養(yǎng)液D-葡萄糖濃度為35mmol/L。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)調(diào)零孔。分別于培養(yǎng)后6 h、12 h、24 h、48 h、96 h進(jìn)行M TT檢測(cè)。為排除培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分消耗對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響,每隔48 h換 1次培養(yǎng)上清。反應(yīng)結(jié)束后每孔加入 25 μL M TT(5 mg/mL)溶液,繼續(xù)孵育4 h,棄上清,每孔加入100 μ L二甲基亞砜(DMSO),在微型混合器上振蕩30 min后于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)光吸收(OD)值。

1.4 RT-PCR方法檢測(cè)HGFmRNA的表達(dá)

1.4.1 總RNA的提取 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞以2×105/mL的密度轉(zhuǎn)種于50 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,同步化后分為兩組,對(duì)照組培養(yǎng)液含D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L。高糖組培養(yǎng)液含D-葡萄糖濃度為25 mmol/L。每組同時(shí)重復(fù)3次。于培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、96 h 后用 Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,提取的細(xì)胞總RNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度;OD260與OD280比值為1.8～2.0,說(shuō)明 RNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.4.2 RT-PCR HGF根據(jù)Genebank的大鼠HGF基因cDNA序列由Primer3軟件設(shè)計(jì):上游引物:5'-ACA GCT TTT TGC CTT CGAGCT A-3';下游引物:5'-CAT CAA AGC CCT TGT CGG GAT A-3'。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度290bp。內(nèi)參照為GAPDH,引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[2]:正義序列:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',反義序列:5'-TCCACCA CCCTGTTGCTGTA-3';PCR反應(yīng)參數(shù)為:預(yù)變性94℃5 min,變性94℃30 s,退火 58 ℃30 s,延伸72 ℃45 s,共 30個(gè)循環(huán),再延伸72℃5 min;預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為450bp。

1.4.3 PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 用0.5×TEB制備1.8%瓊脂糖凝膠,在0.5×TEB中恒壓電泳,完畢后經(jīng)紫外凝膠圖像分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以目的基因mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物的紫外OD值與內(nèi)參照GAPDHmRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物紫外OD值的比值作為HGFmRNA的相對(duì)值。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同作用時(shí)間的細(xì)胞增殖 對(duì)照組(5.5 mmol/L組)細(xì)胞從6 h～96 h持續(xù)增殖。EC304在高糖的誘導(dǎo)作用下,6 h時(shí)各組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差別,但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),作用12 h時(shí),細(xì)胞增殖較對(duì)照組明顯增強(qiáng),且隨著濃度的增加,細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng),細(xì)胞增殖致24 h達(dá)高峰,48 h細(xì)胞增殖被抑制,細(xì)胞數(shù)量較24 h明顯減少,出現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象,96 h細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步減少,且呈濃度依賴性。詳見(jiàn)表1。

表1 高糖對(duì)EC304細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 高糖對(duì)EC304細(xì)胞增殖的影響(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h 5.5 mmol/L組 0.221±0.012 0.290±0.008 0.401±0.011 0.625±0.005 0.990±0.025 15 mmol/L組 0.227±0.010 0.357±0.0081) 0.474±0.0051) 0.428±0.0071) 0.376±0.0111)25 mmol/L組 0.223±0.010 0.419±0.0071) 0.536±0.0061) 0.435±0.0061) 0.309±0.0101)35 mmol/L組 0.222±0.009 0.470±0.0101) 0.664±0.0121) 0.448±0.0071) 0.222±0.0111)與對(duì)照組(5.5 mmol/L)相比,1)P＜0.05

2.2 各組細(xì)胞HGFmRNA的表達(dá) 作用6 h,高糖組HGFm RNA的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差別,作用12 h,高糖組HGFmRNA的表達(dá)較對(duì)照組升高,作用24 h,HGFmRNA的表達(dá)開(kāi)始降低,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),HGFmRNA的表達(dá)逐漸降低,即高糖降低HGF mRNA的表達(dá)。詳見(jiàn)表2。

表2 高糖對(duì)EC304 HGFmRNA表達(dá)的影響(±s)

表2 高糖對(duì)EC304 HGFmRNA表達(dá)的影響(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h對(duì)照組 0.839±0.047 0.840±0.033 0.827±0.052 0.867±0.033 0.859±0.032高糖組 0.816±0.069 1.451±0.1261) 0.756±0.620 0.611±0.0191) 0.422±0.0121)與對(duì)照組相比,1)P＜0.05

3 討 論

糖尿病以慢性高血糖為共同特征。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種血管活性物質(zhì),血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化;高血糖造成內(nèi)皮細(xì)胞功能失常,使多種內(nèi)皮細(xì)胞源性因子如HGF、前列腺環(huán)素(PGI2)、一氧化氮(NO)、C型利鈉素(CNP)等合成減少,導(dǎo)致血管的硬化改變[3],因而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞可抑制動(dòng)脈粥樣硬化,減少糖尿病人群心腦血管病患病率。

血管內(nèi)皮損傷是血管病變的基礎(chǔ),糖尿病有多種因素可直接或間接導(dǎo)致血管壁受損,使內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,內(nèi)皮損傷可能是動(dòng)脈粥樣硬化起始過(guò)程,隨后出現(xiàn)血小板生長(zhǎng)因子釋放,后者引起血管平滑肌增生[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察到高糖早期通過(guò)上調(diào)HGFmRNA的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,晚期HGFmRNA表達(dá)下調(diào),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。高糖刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞早期增殖可能的機(jī)制之一是:血管內(nèi)皮細(xì)胞作為對(duì)高糖損傷應(yīng)激性地引起HGF分泌增加,即高糖環(huán)境下12 h,HGFmRNA表達(dá)上調(diào),細(xì)胞增殖明顯增加,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,HGFmRNA表達(dá)下調(diào)。高糖環(huán)境下bax-caspase蛋白激酶被激活而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且濃度增加細(xì)胞死亡明顯增加,高葡萄糖主要增加bax蛋白,而不影響bcl-2,并且激活 caspase3和caspase9;而 HGF主要增加bcl-2的表達(dá),影響 bax水平,并且減少 caspase3和caspase9的活性;高D-葡萄糖引起bax蛋白的遷移也能夠被過(guò)度表達(dá)bcl-2完全阻斷[5]。另外高濃度D-葡萄糖通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)分泌抑制局部 HGF產(chǎn)生,而 HGF具有明顯的促細(xì)胞有絲分裂增殖作用,給予TGF-β抗體可以抑制這種減少[6]。因而HGF系統(tǒng)在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化中具有重要作用。

臨床可應(yīng)用HGF抑制或延緩動(dòng)脈粥樣及促進(jìn)新生血管形成。Morishita等[7]對(duì)患有嚴(yán)重肢體缺血性疾病患者給予HGF質(zhì)粒DNA治療,認(rèn)為肌注HGF質(zhì)粒DNA治療是安全有效,并且能夠獲得成功治療。

HGF系統(tǒng)在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化中具有重要作用,HGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成,抑制其凋亡,在內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與增殖平衡中發(fā)揮重要作用,維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能;抑制動(dòng)脈粥樣硬化,減少糖尿病患者心腦血管的并發(fā)癥。

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[7] Mo rishita R,Aoki M,Hashiya N,et al.Safety evaluation of clinical gene therapy using hepatocyte growth factor to treat peripheral arterial disease[J].Circulation,2004,44(2):203-209.