鹿茸方對糖尿病腎病大鼠TIMP-1m RNA表達的調節

王好杰,張 潔,葉偉成,倪培華

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)患者常見的并發癥之一,是導致終末期腎衰竭(ESRD)的重要原因。據美國DM協會統計,DN已經成為ESRD的主要原因。因此尋找防治DN的有效藥物已成為全球DM界所共同關注的重點課題之一。既往在用鹿茸方治療DN中,臨床觀察和動物實驗均證明,臨床總有效率達89.47%,能有效降低DN患者及鏈脲菌素(STZ)DN模型大鼠的尿微量白蛋白排泄率(UAER),調節一氧化氮和內皮素代謝,下調DN大鼠腎臟醛糖還原酶(AR)m RNA的表達,下調腎皮質TGF-β1m RNA的表達。同時既往運用基因芯片對DN模型大鼠腎組織部分基因表達篩選的研究結果表明,DN模型大鼠的腎皮質組織型基質金屬蛋白酶抑制劑-1(Tissue Inhibitor of Metallop roteinase-1,TIMP-1)m RNA表達明顯上調,提示與DN的發生發展有著一定的關系。本課題在鹿茸方既往研究基礎上,運用鏈脲菌素誘導的DN大鼠模型結合鹿茸方的干預治療,來觀察鹿茸方對腎皮質TIMP-1 mRNA表達的影響,在分子水平上探討鹿茸方防治DN的可能療效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠45只(由中國科學院上海實驗動物中心提供),體重180 g～200 g。

1.2 實驗藥物 鹿茸方由菟絲子、鹿角片、肉蓯蓉、生地黃、補骨脂、懷牛膝、益母草、黃芪組成,為水煎后濃縮藥液,相當于3 g/m L。水飛薊賓片(益肝靈片)由上海復星朝暉藥業有限公司提供,每片38.5mg。

1.3 實驗試劑及儀器 OTRIzol試劑(GIBco BRL公司);PCR Marker DL2000 M arker(Takara公司);STZ(Sigma公司)。高速低溫離心機;-80℃冰箱;紫外分光光度計UV1240;DYNEX OPSYSMR酶標儀;PTC 200 DNA擴增儀;雅培全自動生化分析儀;電泳儀;凝膠成像系統;引物序列:TIM P-1上游引物P1 5'TCCCCAGAAATCATCGAGAC 3',下游引物P 2 P 2 5'TGGCTGAACAGGGAAACACT3',產物長度328bp,Beta-actin上游引物P1 5'GGCATCCTGACCCTGAAGTA 3',下游引物P2 5'AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG3',產物長度614bp。RTPCR檢測所檢測的基因及內參照β-ac tin引物序列由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.4 DN造模及分組 健康雄性W istar大鼠45只,取40只大鼠腹腔注射STZ(45mg/kg,溶解在0.1mol/L滅菌枸櫞酸鈉緩沖液中,pH=4.0),另外5只僅注射等量的上述滅菌枸櫞酸鈉緩沖液。4周后用金屬代謝籠收集大鼠24 h尿液,測定UAER,在(30～300)mg/24 h者視為DN造模成功。

將造模成功者33只隨機分為4組,模型組9只,鹿茸方小劑量治療組8只,鹿茸方中劑量治療組8只,水飛薊賓治療組8只。另設僅注射上述滅菌枸櫞酸鈉緩沖液大鼠為正常對照組(5只)。

1.5 給藥方法 正常對照組和模型組給予生理鹽水灌胃,每次2 m L,每日1次。鹿茸方小劑量組和中劑量組分別為成人劑量的10倍[(25 g/(kg?d)]、20倍[50 g/(kg?d)]用藥,給予鹿茸方水煎濃縮劑灌胃。水飛薊賓組給予水飛薊賓[38.5mg/(kg?d)]灌胃,1次/日。上述處理用藥8周。

1.6 檢測指標和方法

1.6.1 UAER測定 由曙光醫院檢驗科生化室協助測定,采用美國雅培ABBOTT-AREOSET全自動生化分析儀測定,試劑為原裝試劑。

1.6.2 腎臟皮質TIMP-1 m RNA表達的測定 組織總RNA的提取。將腎皮質組織,放入Eppendorf管中,加TRIzol試劑,200μL氯仿,4℃12 000轉離心15 min,加入500μL異丙醇,RNA沉淀中加入1 m L DEPC水配制的75%乙醇。取含有RNA液1μL加100μL DEPC水,用紫外分光光度計定量OD260/OD280,此值在1.8～2.0,提示得到純凈的總RNA。RT-PCR反應,反轉錄體系,DEPC ddH2O 5μL,總RNA 3μg,100 pmoL隨機六聚體引物1μL,然后加雙蒸水至11μL,65℃10m in,孵育5m in,然后置于冰上順序加入:5×反轉錄酶緩沖液4μL,1 0mmo/L dNTP 1μL,1 0 0mmol/L DTT 2μL,M-MLV 1μL,RNasin 1μL,37℃60m in,-20℃保存。擴增條件包括25μL PCR體系,瓊脂糖凝膠上進行電泳,在紫外燈下觀察結果并拍照保存。測定其光密度或密度掃描儀對特異性條帶進行掃描。

1.7 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件統計。計量資料用均數±標準差(±s)表示,組間比較用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠UAER的比較(見表1) 模型組及3個治療組UAER較正常對照組顯著升高(P＜0.05);3個治療組較模型組顯著降低(P＜0.05);水飛薊賓組較鹿茸方小劑量組、鹿茸方中劑量組顯著升高(P＜0.05);小劑量組和中劑量組間比較無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠24 h尿量、UAER的比較(±s)

表1 各組大鼠24 h尿量、UAER的比較(±s)

組別尿量(m L)UAER(mg)正常對照組 8.00±2.55 5.73±1.70模型組155.13±27.741)118.70±24.631)鹿茸方小劑量組99.00±38.501)2)3)62.73±18.661)2)3)鹿茸方中劑量組92.40±28.411)2)3)62.16±13.171)2)3)水飛薊賓治療組139.00±27.621)89.20±21.561)2)與正常對照組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05;與水飛薊治療賓組比較,3)P＜0.05

2.2 各組大鼠腎皮質TIMP-1 mRNA表達比較(見表2) 模型組及3治療組TIMP-1 mRNA表達較正常對照組顯著升高(P＜0.05);3個治療組TIMP-1mRNA表達較模型組顯著下調(P＜0.05);治療組間比較無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠腎皮質TIMP-1基因表達的比較(±s)

表2 各組大鼠腎皮質TIMP-1基因表達的比較(±s)

組別TIMP-1正常對照組0.352 0±0.148 3 DN模型組1.360 7±0.274 01)鹿茸方小劑量組0.797 8±0.132 41)2)鹿茸方中劑量組0.654 4±0.075 91)2)水飛薊賓治療組0.766 8±0.381 41)2)與正常組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05

2.3 各組大鼠腎皮質TIMP-1mRNA表達電泳圖譜(見圖1)

圖1 各組大鼠腎皮質TIMP-1基因表達電泳圖

3 討 論

伴持續性微量白蛋白尿約80%的1型DM患者和約20%的2型DM患者10年之內發展至臨床DN[1]。A lmdal等[2]觀察發現,伴微量白蛋白尿(30 mg/24 h＜UAER＜300 mg/24 h)的患者在5年內有18.6%發展至臨床DN(UAER≥300 mg),無尿微量白蛋白尿的患者僅有1.8%發展至臨床DN。因此,在DN的早期積極進行干預治療是非常重要的。DN從第Ⅲ期開始出現典型的糖尿病性腎小球硬化癥,其基本病理改變是腎小球毛細血管基膜增厚和系膜區的擴張。腎小球ECM積聚是引起腎小球系膜區擴張、基膜增厚和導致腎小球硬化的主要病理基礎。雖然ECM在腎小球內積聚的過程及其發生機制十分復雜,但歸納起來則是腎小球內ECM合成過程增強或降解過程受到抑制的結果。腎小球ECM的合成增加和(或)降解減少,打破原有的平衡,引起ECM更新轉換失去平衡,導致ECM的過度積聚,進而進展為腎小球硬化[3]。MMPs/TIMPs系統與ECM的降解關系密切。MMPs是迄今為止發現的唯一能分解纖維類膠原的酶[4,5],MMPs是ECM降解酶系中最重要的一大酶系超家族,MM Ps降解幾乎所有ECM成分。組織型基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)是MMPs的天然特異性抑制劑,是對MMPs的轉錄后調節,激活后可以與MMPs的活性部位特異性結合,阻止MMPs與其底物的相互作用,從而降低MMPs的活性,減少ECM的降解,促進DN的發生發展。目前已經鑒定的TIM Ps有4種,分別為:TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4[6]。其中TIMP-1是體內存在和作用最廣的一種TIMP,在腎臟主要表達于腎小球系膜細胞、內皮細胞、上皮細胞,是大多數MM Ps的抑制物。實驗已經證實,腎小球內3種固有細胞特別是系膜細胞除合成ECM外,在高血糖的誘導下均可合成和分泌TIMPs和MMPs。Wu等[7]STZ制成DM大鼠模型,發現與對照組相比,實驗組TIMP-1明顯升高。Phillips等[8]在培養的人腎小管上皮細胞內加入25 mmol/L的葡萄糖24 h后,發現TIMP-1比對照組增高了8倍,明膠酶活性普遍下降。周巧玲等[9]發現STZ鼠腎組織TIMP-1表達明顯上調。由于高糖等諸多生長因子和細胞因子的相互作用,最終導致腎組織ECM降解系統尤其是MMPs/TIMPs功能的紊亂,即MMPs活性及m RNA表達下降,而TIMPs活性及m RNA表達上調,打破ECM生成和降解之間的平衡,原有的平衡破壞,引起ECM更新轉換失去平衡,ECM生成增多降解減少,導致ECM的過度積聚。

根據中醫對DM的認識,認為DM屬中醫“消渴”范疇?！锻馀_秘要》引甄立言《古今錄驗方》載“渴而飲水不能多,但腿腫,腳先瘦小,陰痿弱,數小便者,此是腎消病也”[10]。上海中醫藥大學附屬曙光醫院丁學屏教授積多年臨床經驗,認為DN病屬“腎消”范疇。消病日久,精微下滲,臟真既虧,陰損及陽,水中無火,氣不化水,因虛致瘀,瘀化為水,泛濫橫溢而為諸癥[11]。謹守病機,治宗陳言《三因極一病證方論》鹿茸方以治[12],該方補腎益氣,滋陰溫陽,疏瘀泄濁。鹿角片,補骨脂,肉蓯蓉溫腎壯陽,生地、菟絲子滋腎填精,黃芪益氣補元,升舉清陽,益母草疏瘀泄濁,活血利水,懷牛膝引諸藥直達下焦以為佐使。合而成方,滋化源補陰陽以復開闔,司其屬令條達以致和平。在臨床上取得較好療效。鹿茸丸復方治療DN患者38例總有效率89.47%[13],能顯著降低早期DN患者UAER[14]。鹿茸丸復方能降低STZDM模型大鼠24h UAER、β2-微球蛋白(β2-MG),調節一氧化氮,內皮素代謝[15],能顯著降低DM模型大鼠紅細胞山梨醇,腎臟皮、髓質山梨醇,以及下調模型大鼠腎皮質、下調髓質AR基因高表達[16],顯著下調糖尿病腎病大鼠轉化生長因子-β1的高表達[17],提示鹿茸方通過多個途徑起到治療糖尿病腎病的作用。

本實驗研究發現,DN模型組大鼠腎皮質TIMP-1m RNA較正常大鼠明顯升高,說明DM大鼠內環境的紊亂促進了TIMP-1 mRNA的表達,從而抑制了基質金屬蛋白酶的活性,最終導致ECM降解減少,合成增多,促進DN的發生發展。經治療后,UAER較DN模型組明顯降低(P＜0.05),提示鹿茸方能通過降低TIMP-1mRNA的表達,恢復基質金屬蛋白酶的活性,加強ECM降解的作用。這也是鹿茸方發揮療效的分子機制之一。本研究對鹿茸方發揮療效的分子機制有了新的認識,為鹿茸方多靶點發揮療效提供了分子生物學依據。鹿茸方是否還通過其他途徑對DN起到治療作用,尚需要進一步研究。

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