清熱祛濕方對2型糖尿病胰島素抵抗模型大鼠TNF-α影響的實驗研究1)

丁 艷,劉金玲張 潔,曹 瑩,王好杰,王立琴

祖國醫學對消渴、胰島素抵抗(IR)的論述多從陰虛燥熱立論。近年來,濕熱內阻成為2型糖尿病發生發展的重要環節。深入研究濕熱證對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平及IR的影響,對于臨床改善IR和防治由此引起的各種血管并發癥具有十分重要的意義[1]。根據中醫基礎理論及臨床經驗創制了清熱祛濕方。為了進一步探討其療效及作用機制,進行了系統的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性W istar大鼠90只,10周齡,體重(170±20)g,購自山東省試驗動物中心,質量合格證號SCXK(魯)20050004。飼養于山東中醫藥大學動物試驗中心。基礎飼料熱卡配比:碳水化合物占60%,蛋白質占22%,脂肪占10%,維生素及礦物質等成分占8%,高脂飼料:碳水化合物占30%,蛋白質占12%,脂肪占52%(動物脂肪為主),維生素及礦物質等成分占6%。

1.2 藥品 清熱祛濕方藥由濰坊市中醫院制劑室煎制。方劑組成:川黃連12 g,炒蒼術15 g,厚樸10 g,炒枳殼15 g,茵陳30 g,佩蘭12 g,當歸15 g,薏苡仁20 g,玄參12 g,丹參15 g。以上方藥加500m L清水浸泡30 m in,文火煎煮至150 m L,煎煮2次,混合煎取液,水浴濃縮成劑量為2.5 g/m L的藥液,4℃冰箱儲存備用。對照組予二甲雙胍(格華止,中美上海施貴寶制藥有限公司生產,每片500 mg,生產批號:國藥準字H 20023370)。二甲雙胍溶入生理鹽水中配成混懸液,4℃冰箱儲存備用。以上2種藥液均按《人和動物間按體表面積折算的最小劑量比值表》換算。

1.3 試劑和儀器 STZ(美國Califonia chemistry公司),TNF-α(上海晶美生物技術公司的ELISA試劑盒),大鼠專用胰島素放免試劑(北京北方生物技術研究所)。Accuchek advantageⅡ型血糖儀由羅氏公司提供,高速低溫離心機(RC5C型,美國Beckman公司),γ-計數器(FJ-2003150型,瑞典Pharmacia),752型分光光度計(上海分析儀器廠),Elecsys 2010型化學發光儀,7170型自動分析儀,冰箱,恒溫振蕩器等。

1.4 方法

1.4.1 造模及給藥方法 采用喂養高脂飼料加腹腔注射STZ的方法復制IR模型[2]。90只雄性Wistar大鼠隨機分為6組,其中,正常組10只普食飼養,其余每組16只,飼以高脂飼料。1月后,高脂飼料飼養的大鼠給予STZ 30 mg/kg腹腔注射,1周后以空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L為2型糖尿病IR大鼠造模成功。正常組腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)2m L～3 m L,1周后空腹血糖處于正常范圍內為正常組大鼠。取50只模型大鼠隨機分為清熱祛濕方低、中、高劑量組,二甲雙胍組,模型組,每組10只,與正常組一起納入研究。清熱祛濕方低、中、高劑量組分別以清熱祛濕方溶液按4 m l/(kg?d)、8 ml/(kg?d)、16m l/(kg?d)加蒸餾水至4m L灌胃,二甲雙胍組以二甲雙胍100mg/(kg?d)溶于4m L水中灌胃。正常組和模型組均以4m L蒸餾水灌胃。每2周剪尾取血監測血糖1次,以禁食6h的非空腹血糖下降至正常組平均水平或與造模成功時相比有統計學意義為治療有效。于給藥2月后禁食12h,腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉,腹主動脈取血,分離血清,放入-80℃冰箱待檢。整個試驗過程中,數據保留完整的大鼠分別為正常組10只,清熱祛濕方低劑量組7只,中劑量組8只,高劑量組7只,二甲雙胍組7只,模型組7只。

1.4.2 監測項目及方法 分別測定體重、FBG、空腹胰島素(FINS)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、TNF-α,計算胰島素敏感指數(IAI)、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)。

2 結 果

2.1 模型大鼠一般情況 2型糖尿病IR大鼠造模成功后,模型大鼠體重增加,活動減少,進食量、飲水量增加,對外界反應能力下降。各組大鼠治療前后體重比較結果顯示:與治療前比較,清熱祛濕方中、高劑量治療組及二甲雙胍組均可明顯降低大鼠體重(P＜0.05),治療后各組比較,中、高劑量組與二甲雙胍組比較無統計學意義(P＞0.05)。提示清熱祛濕方治療及二甲雙胍治療干預均可減輕模型大鼠體重,且中、高劑量組減輕體重的作用與二甲雙胍組無統計學意義。詳見表1。

表1 各組大鼠治療前后體重比較(±s)g

表1 各組大鼠治療前后體重比較(±s)g

組別n治療前治療后正常組10218.10±4.68207.50±5.91模型組7248.96±7.93249.14±5.73低劑量組7249.29±8.01228.86±6.30中劑量組8251.75±5.01213.25±5.901)高劑量組7248.43±7.22208.86±5.961)二甲雙胍組7250.11±4.54216.57±7.001)

2.2 各組大鼠治療前后TNF-α、TC、TG比較 模型大鼠血清TNF-α水平明顯升高,血脂顯著升高,且以TG升高為主。治療后清熱祛濕方治療組及二甲雙胍組血TNF-α、TC、TG下降(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較,血清TNF-α、TC、TG下降差異有統計學意義(P＜0.05);治療后與二甲雙胍組比較,中、高劑量組血清TNF-α、TG水平降低(P＜0.05)。清熱祛濕方可降低血清TNF-α、TC、TG水平,而且隨著劑量的增大,療效增加。與二甲雙胍治療比較療效更加顯著。詳見表2。

表2 各組大鼠治療前后TNF-α、TC、TG比較(±s)mmol/L

表2 各組大鼠治療前后TNF-α、TC、TG比較(±s)mmol/L

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2.3 各組大鼠FBG、FINS、IAI、HOMA-IR比較 造模成功后,大鼠FBG及FINS明顯升高,胰島素敏感性降低,加重了胰島素抵抗。治療后中、高劑量組及二甲雙胍組FBG、FINS、IAI、HOMA-IR均有統計學意義(P＜0.05),并以中、高劑量組下降最明顯;與模型組比較,中、高劑量組及二甲雙胍組FBG、FINS、IAI、HOMA-IR比較均有統計學意義(P＜0.05);與二甲雙胍組比較,FBG變化無差異,但中、高劑量組FINS、IAI、HOMA-IR變化有統計學意義(P＜0.05)。清熱祛濕方可明顯降低糖尿病大鼠血糖及胰島素水平,增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗,且隨著劑量的增加,療效更加顯著。詳見表3。

表3 各組大鼠治療前后FBG、FINS、IAIHOMA-IR比較(±s)

表3 各組大鼠治療前后FBG、FINS、IAIHOMA-IR比較(±s)

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3 討 論

2型糖尿病屬中醫學“消渴”范疇。在中醫經典論著中沒有與IR相對應的專門論述,但其臨床表現多屬于中醫“肥滿”“眩暈”“消渴”等范疇[3]。如《素問?通評虛實論》指出“消癉,肥貴人,則膏粱之疾也”。祖國醫學對糖尿病、IR多從陰虛燥熱、痰濁血瘀立論。近年來,隨著生活方式及飲食結構的改變,2型糖尿病IR患者多見濕熱中阻者[4]。中醫學認為消渴病的主要病因為長期食用肥甘厚膩之品,復因運動減少,而致脾失健運,運化水濕功能下降,食滯中焦郁而化熱,導致濕熱中阻,津液敷布失常,可見口干多飲,多尿等癥,久而發為消渴。脾失健運,濕熱內蘊是其主要病機。脾虛為本,濕熱為標,故清熱祛濕,健脾行氣是其治療大法,脾氣得健則濕熱自除,在IR的治療中尤為重要。遵“法從證立,方從法出”的組方原則,組成清熱祛濕方。方中川黃連、蒼術、厚樸清熱健脾燥濕行氣為君藥;佩蘭、枳殼化濕行氣,茵陳清熱祛濕,加川黃連清熱祛濕作用為臣藥;當歸、薏苡仁、玄參、丹參活血健脾利濕為佐使藥。諸藥合用共奏清熱祛濕,健脾行氣之功。

TNF-α與IR密切相關[5],而關于中藥改善TNF-α所致IR的報道較少。實驗研究證明,清熱祛濕、健脾行氣治療可明顯降低血TNF-α水平,同時可減輕體重,有效改善糖、脂代謝異常,從而增加胰島素敏感性,改善IR,且隨著劑量的增加療效更加顯著。清熱祛濕治療可明顯改善濕熱內阻型糖尿病患者的IR,其治療作用是多途徑、多靶點、多環節的。該療法為中醫藥防治2型糖尿病IR提供了新的思路和靶點。但上述研究僅限于實驗動物,推廣用于臨床治療尚有待于進一步的研究。

[1] 熊曼琪,朱章志.中醫中藥治療非胰島素依賴性糖尿病必須研究IR[J].中醫雜志,1995,36(1):47-48.

[2] 馬海港,張汝學,賈正平.IR動物模型的研究進展[J].國際內分泌代謝雜志,2008,28(1):33-36.

[3] 仝小林,段軍.代謝綜合征的中醫認識和治療[J].中日友好醫院學報,2002,16(5-6):347.

[4] 丁學屏,陸灝,虞芳華,等.非胰島素依賴型糖尿病中醫辨證分型與胰高糖素、胰島素敏感性相關研究[J].上海中醫藥雜志,1999,33(9):18.

[5] 裴新軍,張靜喆.脂肪細胞因子與IR關系的研究進展[J].醫學綜述,2007,13(16):1201.