月經周期雌激素變化對外周血CD4+CD25+調節性T細胞水平的影響

王巧玲,羅蒲英,熊員煥

(1.南昌大學研究生院醫學部2007級;2.江西省人民醫院婦產科,南昌330006)

CD4+CD25+調節性 T細胞(regulatory T cell,Treg細胞)在維持自身免疫耐受中發揮著重要作用,它的缺失會導致自身免疫性疾病的發生。但是這種細胞的調節因素現在還不是很清楚,大量研究發現雌激素可以促進T reg細胞的增殖[1]。最近Huber S.A.[2]發現轉基因雌鼠在動情期感染柯薩奇病毒(CVB3)后其外周血中 Treg細胞比在其他時期感染時明顯增加,同時還發現給外源性17-β雌二醇予雌性小鼠可以保護它們感染CVB3后不罹患心肌炎,同時體內的 Treg細胞也大量增加。這些研究說明小鼠動情周期中雌激素的變化可以影響T reg細胞。本研究旨在探討人體雌激素的變化對T reg細胞水平的影響,以闡明雌激素對機體免疫功能影響的分子機制,并為雌激素作為免疫調節治療自身免疫性疾病新方法的探索提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2009年10-12月江西省人民醫院體檢中心正常育齡女性20例,年齡 25～30歲,平均26.35歲。月經周期28～30 d。

1.2 主要試劑與儀器

紅細胞裂解液、PBS緩沖液(美國BD公司),FITC anti-human CD4、PE anti-human CD25、同型陰性對照抗體(美國eBioscience公司),碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒(天津九鼎醫學生物工程有限公司)。Beckman coulter XL流式細胞分析儀(美國Bekman Coulter公司),XK96-A快速混勻器(姜堰市新康醫療器械廠),普通冰箱(中國海爾),LD4-2低轉速離心機(北京醫用離心機廠),GC-1200γ-放射免疫計數器(科大創新股份有限公司),電熱恒溫水溫箱(上海醫療器械廠),KDC-2046低速冷凍離心機(科大創新股份有限公司)。

1.3 方法

分別于月經周期第 3、8、13、18、23天采集外周靜脈血。

1.3.1 標本采集

于清晨 8:00～9:00空腹采取外周靜脈血5 mL,其中2 mL置于EDTA抗凝管中混勻,2 h內檢測Treg細胞水平;3 mL置于普通管中,4 h內檢測雌激素。

1.3.2 流式細胞術分析Treg細胞

用 10 μ L 移 液器分別取 FITC-抗 CD4 、PE-抗CD25 20 μ L 加入清潔試管 ;用 100 μ L 移液器向上管加入100 μ L抗凝全血,并充分混勻,同時設同型陰性對照管;室溫避光孵育20 min;加入300 μ L紅細胞裂解液,并用微型混合器震蕩5 s;室溫避光孵育15 min,待紅細胞充分裂解;低轉速離心機以1 400 r?min-1離心 5 min,棄上清液;PBS緩沖液1 mL洗滌1次;加入緩沖液400 μ L重新懸浮細胞;上流式細胞儀檢測,Flowjo v 7.6流式分析軟件分析Treg細胞占外周血CD4+T細胞的百分比。

1.3.3 放射免疫法(RIA)測定外周血清雌激素水平

低轉速離心機以1 400 r?min-1離心5 min,分離血清;NSB管中加入“0”濃度標準品、標記物及蒸餾水各 200 μ L;各濃度(0 、10 、50、100、250 、750、2 000 ng?L-1)標準管中分別加入相應濃度標準品、標記物、抗體各 200 μ L;標本管中加入血清、標記物、抗體各200 μ L;充分混勻后置于37℃水溫箱1.5 h;各管中加入分離劑1 000 μ L;充分混勻,4 ℃3 600 r?min-1離心20 min,棄上清液;各管按次序放置于Υ-放射免疫計數器測量架上,設定參數,配套電腦自動分析雌激素水平。

1.4 統計學方法

2 結果

1) 20例正常女性外周血中雌激素水平呈現周期性變化,于月經周期第13天水平最高,顯著高于第 3、8、18、23天水平(P＜0.05);第 3天水平最低,顯著低于第8、13、18、23天水平(P ＜0.05)。而外周血Treg細胞也隨雌激素水平變化呈現周期性波動,于月經周期第13天水平最高,顯著高于第3、8、18、23天水平(P ＜0.05);第3天水平最低,顯著低于第8、13、18、23天水平(P ＜0.05)。外周血雌激素和T reg細胞水平月經周期第8天與第18天比較差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 月經周期中Treg細胞水平及雌激素水平變化的比較

表1 月經周期中Treg細胞水平及雌激素水平變化的比較

檢測指標 第3天 第8天 第13天 第18天 第23天Treg細胞/% 11.27±1.23 13.52±1.64 20.72±2.24 14.38±1.45 17.33±1.40雌激素水平/(ng? L-1) 37.90±8.94 93.09±11.86 204.27±24.01 105.47±14.45 171.68±19.21

2) 取月經周期第13天外周血雌激素水平及T reg細胞水平進行pearson相關分析,發現 Treg細胞與雌激素水平呈正相關(r=0.615,P＜0.005)。

3 討論

在我國,自身免疫性疾病發病率高、病程長,且預后不佳。其中結締組織病和神經肌肉疾病還有較高的致殘率。近年來,自身免疫性疾病發病率呈逐漸上升趨勢,而在治療上以應用激素和免疫抑制劑短期緩解癥狀為主,效果不佳且不良反應明顯。因而尋找新的有效的治療方法倍受重視。

1995年Sakaguchi S.等[3]發現將 CD4+T細胞中的CD25+細胞剔除后即CD4+CD25-T細胞接種到裸鼠中結果導致裸鼠都發生了自身免疫性疾病,包括甲狀腺炎、胃炎、多關節炎等,而在接種后一定時間內注入Treg細胞可以抑制這些自身免疫性疾病的發生,表明 Treg細胞可抑制自身免疫性疾病的發生。此后的研究表明Treg細胞在外周免疫耐受中發揮重要作用[4],并在自身免疫性疾病中發揮著重要作用。研究還發現雌激素與T reg細胞的關系密切,有學者發現生理劑量的雌二醇(E2)可以促使小鼠CD4+CD25-T細胞向T reg細胞轉化,使不同組織中的Treg細胞增加[5]。

本研究也證實了在女性月經周期中T reg細胞隨著體內雌激素的變化而出現波動,據此推測在女性體內是否因為T reg細胞的波動引起免疫內環境的不穩定狀態,最終引起自身免疫耐受功能異常,導致自身免疫性疾病的發生。這也可以解釋一些臨床現象,如:多發性硬化癥(MS)女性發病明顯高于男性,女性從月經初潮起,MS的發病率逐漸增加,到絕經期達到高峰。筆者認為雌激素可以通過調節T reg細胞而在自身免疫性疾病的發生中起了一定的作用。

在動物實驗中,發現在小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型誘導期口服乙烯雌酚可以抑制EAE的發展[6]。后來的研究發現在MS的動物模型EAE誘導期給予低劑量的E2(劑量在妊娠水平與動情期水平之間)皮下注射,可以顯著抑制不同種系小鼠疾病的發展[7]。Huber S.A.[2]給外源性17-雌二醇予雌性小鼠可以保護它們感染CVB3后不罹患心肌炎,而且體內的T reg細胞也升高,這給筆者一些提示,是否可以將雌激素作為治療自身免疫性疾病的一個新的突破口?筆者將繼續進行系列研究,為雌激素作為免疫調節治療的新方法提供依據。

[1] Polanczyk M J,Hopke C,Huan J,et al.Enhanced Fox P3 expression and T reg cell function in pregnant and estrogen-treated mice[J].Neuroimmunol,2005,170(12):85-92.

[2] Huber S A.Cox sackievirus B3-induced muocarditis:infection of females during the estrus phase of the ovarian cycle leads to activation of T regulatory cells[J].Virology,2008,378(2):292-298.

[3] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 recepto r alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune disease[J].J Immunol 1995,155(3):1151-1164.

[4] Stephens L A,Barclay A N,Mason D.Phenotypic characterization of regulatory CD4+CD25+T cells in rats[J].Int Immunol,2004,16(2):365-375.

[5] Tai P,Wang J,Jin H,et al.Induction of regulatory T cells by physiological level estrogen[J].Cell Physiol,2008,214(2):456-464.

[6] Bebo B F Jr,Fyfe johnson A,Adlard K,et al.Low-dose estrogen therapy ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis in two different inbred mouse strains[J].J Immunol,2001,166(3):2080-2089.

[7] Polanczyk M J,Hopke C,Vandenbark A A,et al.Estrogen-mediated innunomodulation involves reduced activation of effecto r T cells,potentiation of Treg cells,and enhanced espression of the PD-1 costimulatory pathway[J].Neurosci Res,2006,84(2):370-378.