下咽癌中hMLH1和hMSH 2蛋白的低表達及臨床意義

郭 淼,張 超,蘆二永,趙 曉

hMLH 1 與 hMSH 2 是人類錯配修復基因(humanemismatch repair gene, hMMR)家族中非常重要的兩個基因,維持著DNA復制的高保真性及起著控制基因突變的作用,它們的功能缺陷被認為是腫瘤發病的重要機制之一,并成為近年來研究的熱點。有研究表明, hMMR與食管癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤[1]關系密切,但在下咽癌中的表達狀況國內尚未見報道。本實驗通過免疫組化方法檢測下咽癌和正常喉組織中的hMLH1 和hMSH2 蛋白的表達狀況,探討它與下咽癌臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 材料來源下咽癌包括梨狀窩癌、環后癌、咽后壁癌,因后兩種類型較少見,且以放化療為主,故本研究主要討論梨狀窩癌。所檢測組織選自河南科技大學第一附屬醫院2008 ～2010年耳鼻喉科、頭頸外科手術切除存檔的下咽癌石蠟標本50例,標本均為第1次住院的原發下咽癌(梨狀窩癌),術前未進行放療和化療;另選正常喉組織20例作對照。50例下咽癌病例中, T1期16例, T2期24例, T3期10例,T4期0例;高分化鱗癌25例,中分化鱗癌15例,低分化鱗癌10例;有淋巴結轉移12例,無淋巴結轉移38例。

1.2 試劑鼠抗人MLH1、MSH2單克隆抗體試劑,廣譜SP試劑盒, PBS磷酸鹽緩沖液等,均采購于北京中杉金橋生物技術公司。

1.3 實驗方法采用免疫組化SP法,試驗中染色過程按照北京中杉金橋生物技術公司提供的SP試劑盒說明書進行。用北京中杉金橋生物技術公司提供的陽性照片作陽性對照,以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定hMLH1、hMSH2蛋白表達主要位于細胞核和(或)胞漿,胞核和(或)胞漿有棕黃色顆粒為陽性細胞。每張切片隨機觀察5個高倍視野,每個視野記數100個細胞,陽性細胞數<10%為陰性片,陽性細胞數>10%為陽性片。

1.5 統計學處理實驗所得數據均采用SPSS12.0統計軟件進行處理,采用2檢驗分析結果, P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 50 例下咽癌、20 例正常喉組織中hMLH1、hMSH2蛋白陽性率分布見表1,兩組hMLH1蛋白表達差異比較χ2=4.076, P<0.05, hMSH2蛋白表達差異比較χ2=5.23, P<0.05。hMLH1、hMSH 2蛋白在兩種組織中的陽性表達差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 hMLH 1和hMSH 2蛋白在下咽癌和正常喉組織中的表達n(%)

2.2hMLH1、hMSH2蛋白的表達與下咽癌臨床病理特征的關系hMLH1、hMSH2蛋白在下咽癌T分期組間的表達差異無統計學意義(P>0.05),但在不同分化程度、淋巴結轉移組間表達差異具有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 hMLH 1、hMSH 2蛋白的表達與下咽癌臨床病理特征的關系

3 討論

下咽癌的發病機制與其他系統腫瘤的發病機制相似,都與分子水平的基因突變有關,人體細胞中的DNA錯配修復反應過程依賴于幾種人類錯配修復基因產物的參與。迄今為止,已經發現9 個錯配修復基因[2], 分別 是 hMSH 2、hMSH6、hMSH 5、hMSH4、hMSH3、hMLH1、 hPMS1、hPMS2、hMLH3。 hMLH1、hMSH2是其中較為重要的兩種,若其中任何一種基因發生突變導致其產物功能的喪失都將會造成DNA錯配修復功能的異常、缺陷或者喪失。 DNA錯配修復功能的異常、缺陷或喪失將會出現微衛星的不穩定性或復制錯誤陽性,使整個基因組不穩定性增加,從而引起包括癌基因和抑癌基因的一系列改變,發生各種腫瘤[3]。研究證明HMMR功能異常與呼吸、消化道和泌尿系統腫瘤的發病有密切關系。

本研究發現, hMLH1和hMSH2在下咽癌中表達陽性率明顯低于在正常喉組織中的表達陽性率,在下咽癌中hMLH1和hMSH 2蛋白陽性表達率分別為54%和56%,在正常喉組織中的陽性表達率為80%和85%。由此可以認為,這兩種蛋白的表達在正常喉組織和癌組織由高到低的變化,可能是下咽癌的發生、發展過程中的一個重要事件,其中表達量下調可能助長了細胞的異常增殖活動,促進腫瘤的發生。這兩個蛋白在癌組織中的表達各家報道不一,唐郡等采用免疫組化的方法檢測144例食管鱗癌手術切除標本、30例正常黏膜組織中hMSH2和hMLH1表達情況,并與臨床病理參數作相關分析,結果食管鱗癌組織hMLH1和 hMSH2基因陽性表達明顯下降,與正常食道黏膜相比相差顯著(P<0.01)。 hMLH1和hMSH2表達缺失與年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度無明顯相關,與腫瘤的分化程度和淋巴結轉移有關(P<0.01)[4]。以上研究均表明多種惡性腫瘤的發生都伴隨著錯配修復蛋白結構或功能的異常,常表現為hMLH1和(或)hMSH2蛋白表達的減少。但也有研究發現相反的結論,范凱[5]等研究結果顯示,hMSH2蛋白在胃癌中的陽性表達率40%,較正常胃組織中高,董莉[6]等研究發現hMSH2蛋白在子宮內膜癌中高表達,出現此現象的原因可能是在一些致癌因素長期反復的刺激下,某些增殖活躍的細胞會出現基因的多點突變以及DNA復制上的錯誤,導致hMSH2蛋白代償性的表達上調。

本研究還發現, hMLH1和hMSH2兩種蛋白在臨床分期中的表達差異無統計學意義,而在高分化、中分化到低分化下咽癌中兩種蛋白的陽性表達率有顯著下降。對于惡性腫瘤來說,分化程度是腫瘤的惡性程度及預后的重要指標之一,因此檢測hMLH1 和hMSH2兩種蛋白對于下咽癌的預后有非常重要的意義。另外在有淋巴結轉移的下咽癌病例中, hMLH1和hMSH2兩種蛋白的陽性表達率顯著低于沒有發生淋巴結轉移的病例,由此認為hMLH1和 hMSH2蛋白與下咽癌的淋巴結轉移有關,在下咽癌的發展過程中持續作用。本實驗研究結果與大多數研究結果類似[4,7]。

綜上所述, hMLH 1和hMSH 2蛋白在下咽癌中的表達下調,可能在下咽癌早期發生中起著重要的作用,并且這兩種蛋白的表達程度很可能與下咽癌的發展及預后有密切關系。因此,聯合檢測hMLH 1和hMSH2基因蛋白將在下咽癌早期的預警、診斷及其預后評估中產生重要的臨床意義,并可能成為基因治療新的靶點。

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