質粒pcDNA3.1-IL-24的制備和純化

韓依辰, 殷玉和, 孫 博, 劉新濤, 吳叢梅*

(1.長春工業大學化學與生命科學學院,吉林長春 130012;2.長春百克藥業,吉林長春 130021)

0 引 言

IL-24(白細胞介素-24)具有免疫調節作用。研究證實,IL-24基因可以有效殺傷腫瘤細胞,促進旁觀者抗腫瘤效應[1],誘導腫瘤細胞凋亡。同時,對正常組織卻沒有損傷,是一種理想的腫瘤治療基因[2-4]。研究發現,重組質粒pcDNA3.1-IL-24能高效表達白細胞介素-24,以此質粒作為載體導入靶細胞進行腫瘤基因治療有較廣闊的應用前景。因此,探索大規模制備、純化質粒DNA的工藝即成為重要的研究任務。

然而,在大腸桿菌細胞溶解產物中,質粒DNA僅僅占全部核酸的2%(w/w),大量存在的RNA和蛋白質必須在后續步驟中除去。由于DNA難于與RNA有效分離,在制備質粒DNA時,不得不引入外源RNA酶A(RNaseA)以去除RNA雜質,這就使得最終產品存在一定的安全隱患[5]。為克服質粒DNA制備過程中有毒化學物質和動物源性酶類污染及雜質去除不徹底等缺陷,本研究探討了質粒DNA的純化方法,即利用異丙醇和LiCl沉淀法初步去除大分子RNA和蛋白,然后,以DEAE Sepharose FF離子交換層析法去除染色體DNA、小分子RNA、蛋白質等關鍵雜質,并對最終產品進行質量檢測,為大規模制備基因治療用質粒DNA奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 質粒與菌株

pcDNA3.1-IL-24質粒由吳叢梅博士構建[6],含有氨芐青霉素抗性基因為篩選標記基因,大小為7.6 kb。大腸桿菌E.coli DH5α由吉林大學疫苗中心保存。

1.2 試劑及儀器

胰蛋白胨、酵母提取物;

陰離子交換層析柱填料DEAE Sepharose FF,購自美國GE公司;

BCA蛋白檢測試劑盒,購自Pierce公司;

多功能自控發酵罐為New Brunswick Scientific公司BIOFLO 5000 40 L發酵罐;

核酸蛋白檢測儀,購自美國Pharmacia公司;酶標儀,購自Beckman公司。

1.3 細菌發酵

大腸桿菌感受態細胞按文獻[7]進行。將質粒pcDNA3.1-IL-24轉化感受態細胞[8]。挑取單個菌落,接種4 mL M9培養液,過夜培養后接種2 L M9培養液,繼續培養4～6 h,作為發酵菌種。發酵菌種接種發酵基礎培養基(蛋白胨2 g/L,酵母提取物5 g/L,K2HPO47 g/L,Na2HPO46 g/L,(NH4)2SO42 g/L,葡萄糖5 g/L,硫酸鎂2 g/L,Amp 100 μ g/mL)后,按20 L發酵規模于37℃培養,6 h后流加4 L補充培養基(葡萄糖100 g/L,酵母提取物20 g/L,干酪素10 g/L,Amp 100 μ g/mL),繼續培至溶氧值迅速上升。16 h結束發酵,離心收集菌體,稱重后保存于-20℃。

1.4 堿性裂解提取質粒

取640 g發酵菌體,重懸于5 L溶液Ⅰ(50 mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl,10 mmol/L EDTA,pH值為8.0)中,充分混勻,冰浴10 min。隨即緩緩加入5 L溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH,2%SDS),溫和混勻后,冰浴5 min。然后立即加入5 L冰預冷的溶液Ⅲ(3 mol/L乙酸鉀),充分混勻,冰浴30 min。加入5 L CaCl2(2 mol/L),冰浴2 h。4層滅菌紗布過濾,離心(4 000 r/min,30 min),得到澄清裂解液。

1.5 質粒DNA粗純

將澄清裂解液中加入0.6倍體積異丙醇,室溫放置30 min,12 000 r/min,離心30 min,收集沉淀,重懸于150 mL TE溶液中,待沉淀完全溶解,加入等體積5 mol/L冰預冷的LiCl,混勻后,室溫放置30 min,12 000 r/min,離心30 min。取上清液,加入等體積異丙醇,混勻,室溫放置1 h,室溫下,12 000 r/min,離心10 min。

1.6 DEAE Sepharose FF離子交換柱精純質粒DNA

將色譜填料DEAE Sepharose FF按產品說明填裝到色譜柱中,用流動相Ⅰ(0.5 mol KAc,pH值為5.5)平衡色譜柱,含有質粒DNA的樣品上柱后,再用流動相Ⅰ平衡,然后分別用流動相Ⅱ(0.3 mol NaC1,25 mmol Tris,10 mmol EDTA,pH值為8.0)、流動相Ⅲ(0.5 mol NaC1,25 mmol Tris,10 mmol EDTA,pH值為8.0)洗脫,流速為40 mL/min,分別收集洗脫峰進行檢測,流動相Ⅳ(2 mol NaCl,0.5 mol NaOH)在位清洗。

1.7 質粒DNA的質量評價

1.7.1 殘留蛋白質檢測

用BCA蛋白檢測試劑盒檢測樣品中蛋白質濃度。100 μ L樣品與100 μ L BCA試劑反應,37℃水浴放置30 min,檢測其在562 nm處的吸收值。

1.7.2 DNA純度檢測

采用分光光度法對質粒DNA進行定量,在260 nm和280 nm兩個波長下讀數。在260 nm的讀數用于計算樣品中的DNA濃度,即1OD260=50 μ g雙鏈DNA;根據260 nm和280 nm讀數的比值(OD260/OD280)估算DNA的純度。

1.7.3 抗生素殘留試驗

抗生素檢定培養基按說明書制備。陽性對照為氨芐青霉素,以生理鹽水為陰性對照。不銹鋼管(內徑0.5 cm,高1 cm)內裝液體200 μ L。將已過夜活化的枯草桿菌用無菌水稀釋,混勻,均勻涂布到抗生素檢定培養基平板上,放平,凝固。在上述測定板上均勻放置不銹鋼管,分別加入陽性對照氨芐青霉素200 μ L,生理鹽水、待測質粒各200 μ L。標號后,38℃下培養24 h,觀察抑菌圈情況并拍照。

2 實驗結果

2.1 質粒DNA精純

EAE Sepharose FF純化pcDNA3.1-IL-24色譜圖如圖1所示。

圖1 DEAE Sepharose FF純化pcDNA3.1-IL-24色譜圖

從洗脫曲線及電泳結果可見,NaCl濃度為0.3 mol/L時,RNA被洗脫下來,見圖1中“RNA”峰。NaCl濃度為0.5 mol/L時,出現質粒DNA洗脫峰,見圖1中“plasmid”峰。

經DEAE Sepharose FF離子交換色譜純化后,RNA被有效去除,電泳未檢測到RNA殘留,如圖2所示。

1.RNA洗脫峰;2.質粒原樣;3.DNA洗脫峰;4.Marker

2.2 質粒DNA中殘留蛋白質檢測

BCA標準曲線如圖3所示。

圖3 質粒DNA的BCA蛋白標準曲線

其相關系數R2為0.997,具有較好的直線性相關性。檢測結果顯示,精純后雜質蛋白的含量為0.007 μ g/mL質粒DNA,說明本純化工藝能有效去除質粒DNA中的蛋白雜質。

2.3 質粒DNA的濃度和純度

采用分光光度法對生產的質粒DNA定量,質粒DNA濃度為727 μ g/mL,A260/A280值為1.87,制備的質粒DNA具有較高的純度。

2.4 質粒DNA抗生素殘留檢查

觀察抑菌圈情況并拍照,結果如圖4所示。

測定板上陽性對照氨芐青霉素孔可見明顯的抑菌圈,而生理鹽水和質粒DNA樣品孔無抑菌圈,即無抗生素殘留。

圖4 質粒DNA抗生素檢測圖

3 討 論

下游工藝中純化質粒DNA的經典方法是氯化銫-溴化乙錠梯度離心法。此方法過程復雜,耗時長,且使用了有毒物質溴化乙錠,就安全性而言,不適用于藥用級質粒DNA的生產。除此方法外,還有各具特色的質粒純化試劑盒可供選擇,這些商業試劑盒純化效果好,卻因為價格昂貴不能應用于大規模生產。在本工藝中,先通過高鹽沉淀來去除大分子RNA、蛋白質、宿主DNA聚凝物,再通過離子交換色譜進行質粒純化,可有效去除內毒素等主要雜質[9-10]。

考慮到經濟合理性和產品安全性,本工藝生產流程避免使用有毒試劑(苯酚、氯仿)和動物源性酶類(RNA酶),確保了產品的安全性的同時,也減少了檢測有毒試劑殘余量的繁瑣步驟;本工藝大量使用的國產試劑價格低廉,材料和設備可以再生使用。生產周期較短,具有良好的經濟性,可以滿足實際生產需求;此外,本工藝操作簡單、易于放大、重復性好,并且建立了相應的質粒DNA質量檢測體系,對于藥用級質粒DNA大規模制備具有重要的現實意義,也為同類研究奠定了理論基礎,為進一步的工業化生產提供了借鑒。

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