柴胡桂枝湯揮發油對 Fmr1基因敲除小鼠腦組織超氧化物歧化酶和丙二醛及一氧化氮的影響

高 飛,黃慶暉,黃越玲,孫衛文,戴麗軍,沈巖松,李敏雄,陳盛強,劉忠民

癲癇是神經系統常見病之一,是由多 種病因引起的慢性腦性疾病,以大腦神經元突發性異常放電所致的突然、反復和短暫的大腦功能障礙為特征。近年來研究表明,癲癇病灶處的能量、氧及血流量有相應的變化,特別是缺氧和缺血后再灌注損傷,可產生大量的氧自由基,并形成自由基連鎖反應。氧自由基能攻擊多不飽和脂肪酸 (PUFA)引發脂質過氧化作用,生成大量的丙二醛 (MDA)及新的氧自由基等復雜產物,繼而引起細胞代謝和功能障礙,參與癲癇對腦的損傷[1-2]。與此同時,一氧化氮 (NO)通過介導谷氨酸(GLU)從突觸前膜釋放后,GLU作用于突觸后膜上的 GLU離子型受體——N-甲基 -D-天冬氨酸受體 (NMDAR),使Ca2+通道開放,Ca2+內流,從而參與了癲癇點燃的過程。柴胡桂枝湯出自 《傷寒論》,是小柴胡湯和桂枝湯的合方,由柴胡、桂枝、黃芩、半夏、芍藥、生姜、大棗、甘草組成,屬于治療太陽和少陽并證的方劑,主要用于太陽少陽合并引起的發熱微惡寒、肢節煩痛、微嘔、心下支結等癥。隨著對柴胡桂枝湯研究的深入,大量文獻報道,柴胡桂枝湯可通過增強 γ-氨基丁酸 (GABA)介導的抑制作用,來調節腦內興奮性神經遞質和抑制性神經遞質含量的平衡[3-4],以降低癲癇發作次數;此外,柴胡桂枝湯具有穩定細胞膜結構,抑制自由基的產生,從而起到抗氧化及延緩衰老的作用。為進一步探討柴胡桂枝湯的抗癲癇、抗氧化作用的機制,本實驗擬用 Fmr1基因敲除小鼠作為模型,觀察其用藥前后行為學改變及腦組織超氧化物歧化酶 (SOD)活性和 MDA、NO水平的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 柴胡桂枝湯揮發油,應用超臨界二氧化碳 (CO2)萃取技術從柴胡桂枝湯中提取,萃取釜壓力 20 MPa,溫度 30℃;解折釜Ⅰ壓力 12 MPa,溫度60℃;解折釜Ⅱ壓力 60 MPa,溫度 40℃。

1.2 實驗動物 Fmr1基因敲除型 (KO)純合子 (-/-)及其野生型 (WT)純合子 (+/+)FVB近交系小鼠,由荷蘭伊拉斯塔斯大學細胞生物學及遺傳學研究中心 Oostra BA教授惠贈,廣州醫學院實驗動物中心飼養及繁殖。實驗動物的操作及飼養均符合廣東省及廣州醫學院實驗動物管理飼養條例,遵循人道原則。

1.3 實驗試劑與儀器 (1)試劑:SOD、MDA、NO測定試劑盒 (南京建成生物工程研究所);(2)儀器:Bio-rid酶標儀、低速離心機、曠場分析箱。曠場分析箱的制作:用一塊黑色膠板做成一個邊長為 72 cm的正方形,用膠紙作線條分成 16個邊長為 18 cm的正方形,該板中心作一個邊長為 18 cm的正方形,在該板邊緣 2 cm處圍成一個邊長為 68 cm的正方形,從邊緣到中心小正方形依次命名為第一區、第二區、第三區、第四區,第四區也叫中央區。再以該板為底面做成無蓋長方體 (72 cm×72 cm×60 cm)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物的基因型鑒定

1.4.1.1 PCR擴增的引物合成 針對Fmr1基因敲除型和野生型 FVB純系小鼠的基因型設計引物:引物 M2 5′-AGTCATGCTATGGATATCAG-3′和 N2 5′-TGGGCTCTATGGCTTCTGA-3′, 用于 檢測基因敲除小鼠 Fmr1中包含新霉素插入片段的等位基因片段 (擴增產物的大小約為 800 bp)。引物 S1 5′-GTGGTTAGCTAAAGTGAGGATGAT-3′和 S2 5′-CAGGTTTGTTGGGATTAACAGATC-3′,用于檢測野生型小鼠的 Fmr1等位基因的片段 (擴增產物的大小為 468 bp)。

1.4.1.2 DNA的提取和定量 (1)DNA的提取:取小鼠尾巴 1.5 cm裝在1.5 ml離心管中并編號,加 500μl蛋白酶 K溶解尾巴,溶解后加 500μl Tris平衡酚用震蕩機大力搖勻 30 s;離心 5 min(13 000 r/min);取上清液于另一離心管中并加 500μl氯仿異戊醇,用震蕩機大力搖勻 30 s;離心 5 min(13 000 r/min);取上清液于另一離心管中,加 40μl 3 mol/LNaAC(pH 5.2),再加 1 ml無水乙醇,用手搖勻,可見絮狀 DNA;離心 5 min(13 000 r/min);倒掉上清液保留離心管底部灰白色沉淀,加 1 ml 75%乙醇,用震蕩機大力搖勻 30 s;離心 5 min(13 000 r/min);倒掉上清液,晾干,加380μl TE溶液,保存在溫度為 55℃的溫箱里 5 min。(2)DNA的定量:取 2.5μl洗脫液稀釋 20倍后,加入比色杯,測定OD值。

1.4.1.3 PCR擴增 PCR反應總體積為30μl,含 DNA 100 ng、 TaqDNA聚合酶1.0 U、引物各 0.35μmol/L、dNTP 200 μmol/L、10×TaqBuffer 3 μl和雙蒸水。PCR擴增條件為:熱啟動,94℃預變性 5 min,然后以下列溫度和時間循環 30次:94℃30 s,65℃30 s,72℃1.5 min。末次循環后均于 72℃延伸 10 min,4℃保存。

1.4.1.4 1.5%瓊脂糖凝膠電泳 分別取PCR擴增產物 8μl、10×Loading Buffer 1 μl在含 0.5 mg/L溴化乙錠的 1.5%瓊脂糖凝膠中以 100 V電泳后于凝膠成像儀中觀察拍照。

1.4.2 曠場實驗方法

1.4.2.1 分組 健康的 FVB小鼠分為KO空白組、KO用藥組;WT空白組、WT用藥組共 4組,每組 15只,普通級,雌雄兼用,體質量 (15士 3)g,日齡為30 d。用藥組腹腔注射柴胡桂枝湯揮發油(1.7 ml/kg)。空白組腹腔注射植物油,注射方式、劑量以及觀察方法同用藥組。

1.4.2.2 曠場實驗 把制作好的曠場分析箱放在光線充足的地方,在底面放一塊透明玻璃,在其正上方安裝好攝像機,調整好錄像畫面;將出生 30 d的小鼠從曠場箱邊緣放入,讓其自由爬行,并記錄下小鼠在曠場中 5 min的行為表現。為防止小鼠在曠場中留下異味,干擾實驗結果,每實驗完一只小鼠用 75%乙醇將透明玻璃擦洗一遍。曠場分析 viewer軟件為德國BIOBSERVE公司產品。

1.4.3 腦組織的取材及腦組織勻漿的制作 給予做完曠場實驗的小鼠 15 min的鈴聲刺激,然后斷頭處死小鼠,迅速在冰塊上分別取出腦皮質、海馬,準確稱重,經預冷 0.9%氯化鈉溶液漂洗去血液,濾紙吸干,制成 10%的組織勻漿,離心取上清作為待檢測標本,用鄰苯三酚自氧化法檢測 SOD,TBA法測定 MDA,硝酸還原酶法測定 NO。

1.5 統計學方法 數據采用 SPSS 13.0統計分析軟件處理,實驗結果用 (x±s)表示,組間比較采用 t檢驗。

2 結果

2.1 實驗動物模型檢測

2.1.1 實驗動物基因型鑒定 KO和 WT小鼠基因 PCR擴增結果如圖 1所示。以M2和 N2為引物,經 PCR在 KO小鼠擴增出約 800 bp的 DNA片斷;以 S1和 S2為引物,經 PCR在 WT小鼠擴增出約 468 bp的 DNA片斷。KO小鼠由于在 Fmr1基因第5個外顯子中插入了一個新霉素片斷,而阻斷了 468 bp DNA片斷的擴增,證實脆性 X綜合征小鼠模型 Fmr1基因缺陷。

2.1.2 Fmr1基因敲除小鼠行為學觀察KO小鼠多動,易激惹,同窩小鼠之間常斗毆,易發癲癇;雄鼠睪丸較大,繁殖力差。

2.2 柴胡桂枝湯揮發油對 WT和 KO小鼠曠場行為學影響 KO空白組與 WT空白組相比,KO小鼠運動的平均速度、總路程及進入各個區的次數均比 WT空白組小鼠大,差異有統計學意義 (P＜0.05,見表 1)。無論是 WT小鼠還是 KO小鼠,用藥組小鼠運動的平均速度、總路程及進入各區的次數均減少,與相應的空白組比較,差異有統計學意義 (P＜0.05,見表2、表 3)。

2.3 柴胡桂枝湯揮發油對 WT和 KO小鼠腦組織 SOD活力及 MDA和 NO水平的影響 WT用藥組小鼠的 SOD活力、MDA和 NO水平與 WT空白組小鼠比較,差異均有統計學意義 (P＜0.05,見表4);KO用藥組小鼠的 SOD活力、MDA和 NO水平與 KO空白組小鼠比較,差異亦均有統計學意義 (P＜0.05,見表 5)。

表 1 WT空白組與 KO空白組小鼠的行為學指標比較 (x±s)Table 1 The comparison of mice behavior indicators between KO control group and WT control group

表 2 WT空白組與WT用藥組小鼠的行為學指標比較 (x±s)Table 2 The comparison of mice behavior indicators between WT control group and WT treatment group

表 3 KO空白組與KO用藥組小鼠的行為學指標比較 (x±s)Table 3 The comparison of mice behavior indicators between KO control group and KO treatment group

表 4 柴胡桂枝湯揮發油對 WT小鼠腦組織SOD活力及 MDA和 NO水平的影響 (x±s)Table 4 Influenceof bupleuriand ramuli cinnamomi decoction on the level of malondialdehyde,nitrogen monoxidum and superoxide dismutase in WT mice

圖 1 KO和 WT小鼠 Fmr1基因片斷 PCR擴增結果 (1.5%瓊脂糖凝膠電泳)Figur e 1 PCR analysis of DNA from a wild type mouse(lane 2),and a heterozygous female(lane 3),a mutant male(lane 4),a mutant female(lane 5).Primer S1 and S2 were used to detect the 468 bp fragment of the wild-type allele(lane4,5),and primer M2 and N2 wereused to detect the 800bp fragment of the konckout allele(lane 4,5).Lane 1 contains a size marker

表 5 柴胡桂枝湯揮發油對 KO小鼠腦組織SOD活力及 MDA和NO水平的影響 (x±s)Table 5 Influenceof bupleuriand ramuli cinnamomi decoction on the level of malondialdehyde,nitrogen monoxidum and superoxide dismutase in KO mice

3 討論

遺傳性智力低下是神經系統疾病中一類主要的疾病,脆性 X綜合征 (fragile X syndrome)是最常見的遺傳性智力低下性疾病之一,其發病率男性約為 1/1 250,女性為 1/2 500,占非特異性智力低下的2%～6%,在 X連鎖智力低下中占 40%。由于 CCG重復序列擴增和繼發啟動子區域甲基化的 FMRI基因沉默,故患者缺少FMRI(fragile x gene)蛋白。Fmr1基因敲除鼠缺乏正常的 FMRI蛋白,表現巨睪癥、記憶力缺失、行為異常和智力低下[5-6]。本研究采用了曠場分析的方法對30日齡的 Fmr1基因敲除小鼠的曠場行為進行觀察。曠場分析能對動物對新異環境的興奮性、適應性、探究、緊張、記憶等多種行為進行評價[7-8],為開展腦的發育及老化過程的研究提供了行為學實驗的參考依據。

Fmr1基因敲除鼠缺乏正常的 FMRI蛋白,表現為多動,易激惹,同窩小鼠之間常斗毆,易發癲癇;雄鼠睪丸較大,繁殖力差。與此同時,由表 1結果可表明,KO空白組與 WT空白組相比,KO小鼠運動的平均速度、總路程及進入各個區的次數均比 WT空白組小鼠大,說明 KO小鼠的探索性、興奮性、運動性均比 WT小鼠要高,這與文獻報道相符。

NO是近年來生物學研究中備受關注的活性遞質[9],NO壽命短,一經形成便可被液體中的氧滅活成 NO-2及 NO-3,故NO-2+NO-3可以準確代表體內 NO水平,本實驗利用硝酸還原酶特異性地將 NO-3還原成 NO-2,然后用比色法測定 NO-2間接反映組織中 NO水平,該法靈敏、簡便、穩定可靠。國內外文獻報道,癲癇發作期 NO水平會增高,并且與癲癇發作的程度和時間成正比。癲癇發作時間越長,癲癇程度越高,NO水平越高。本實驗證實,無論是 WT小鼠還是 KO小鼠,用藥組較空白組腦組織中 NO水平顯著降低。說明柴胡桂枝湯揮發油對 NO的生成有一定的抑制作用。

與此同時,用藥組小鼠腦組織 MDA水平較空白組也顯著降低。MDA脂質過氧化物與癲癇灶內癇樣皮層電 (ECOG)活動的產生和發展有密切關系,具有很強的生物毒性。它是氧自由基攻擊細胞膜的產物,能間接反映細胞損傷的程度。

SOD是機體清除 MDA的關鍵酶,其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。它特異性催化超氧陰離子自由基(O2-)發生歧化反應,再經過氧化氫酶(CAT)轉化成 H2O和 O2,從而消除了O2-的毒性作用,減少癲癇的發生[10]。本實驗中,用藥后的 KO和 WT小鼠的 SOD活力均較空白組顯著提高。由此可知,柴胡桂枝湯揮發油能有效清除自由基、阻止過氧化物生成,減少 NO的神經毒性,具有保護腦細胞的作用。

當然,引起神經元同步放電的因素是多方面的,目前單純使用自由基清除劑治療癲癇不能達到理想效果,尚需與抗癲癇藥物聯合應用。但通過本實驗可以預見,進一步探索癲癇發生的自由基病理機制,開發有效清除自由基的藥物具有廣闊的前景,并將為人類最終戰勝癲癇提供有力的幫助。

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