子宮內膜癌與胰島素-Ras-MAPK信號通路的相關性研究*

田文艷 竇文婷 王穎梅 張麗志 薛鳳霞 張 灝

子宮內膜癌是婦科三大惡性腫瘤之一，近年來發病率呈上升趨勢。子宮內膜癌的發生與多種因素有關，胰島素抵抗與高胰島素狀態可能與子宮內膜癌的發生有關。胰島素存在2條信號通路：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K－Akt）通路及Ras－絲裂原活化蛋白激酶（Ras-MAPK）通路。筆者前期的研究發現PI3K-Akt通路在子宮內膜癌發生發展中起重要作用[1-2]。本研究觀察胰島素-Ras-MAPK信號中的關鍵分子生長因子受體結合蛋白2（growth factor receptor binding protein 2，Grb-2）、Ras、磷酸化-胞外信號調節激酶（P-ERK）、細胞周期素D1（CD-1）在正常子宮內膜、非典型增生子宮內膜、子宮內膜癌組織中的表達，分析其表達與血清胰島素的相關性，探討胰島素-Ras-MAPK信號傳導通路在子宮內膜癌發生、發展中的作用，為子宮內膜癌的靶向治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2004年1月—2007年12月于我院婦產科住院治療患者的石蠟標本。所有患者術前均未接受放療、化療或激素治療。子宮內膜癌（EC）組：51例，年齡32～78歲，平均（56.8±10.1）歲，其中子宮內膜樣腺癌46例，非子宮內膜樣腺癌5例（包括透明細胞癌1例，漿液性乳頭狀腺癌4例）。根據2009年國際婦產科聯盟FIGO標準進行病理組織學分級和手術病理分期。手術病理分期：Ⅰ期38例，Ⅱ期4例，Ⅲ期7例，Ⅳ期2例。其中，無浸潤5例，子宮肌層浸潤深度≤1/2者29例，>1/2者17例。病理組織學分級：Ⅰ級（高分化，G1）25例，Ⅱ級（中分化，G2）17例，Ⅲ級（低分化，G3）9例。子宮內膜非典型性增生（AHE）組：10例，患者年齡32～63歲，平均（48.3±10.2）歲。正常子宮內膜（NE）組：48例，年齡39～80歲，平均（51.4±10.3）歲，其中分泌期20例，增生期28例，正常子宮內膜組織取材于因良性疾患行子宮全切術的患者。所有標本均經經病理復查核實。3組間年齡比較差異無統計學意義（F=0.055，P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 血胰島素水平測定 放免法測定子宮內膜癌患者血清胰島素水平（mU/L）。

1.2.2 免疫組織化學法檢測Grb-2、Ras、P-ERK、CD-1在子宮內膜組織中的表達 所有標本經10%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，用免疫組織化學二步法進行染色。一抗鼠抗人Ras單克隆抗體，一抗鼠抗人Grb－2單克隆抗體，一抗鼠抗人CD－1單克隆抗體購于美國Santa Cruz生物有限公司。一抗鼠抗人P－ERK單克隆抗體、PV-9000通用型試劑盒DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。磷酸鹽緩沖液代替抗體作陰性對照，細胞核用蘇木素復染。已知陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對照。高倍鏡下隨機抽取5個不同的視野，各計數200個細胞，以每高倍視野下陽性細胞數量及染色強度判斷。評價標準：根據陽性細胞染色深淺及陽性細胞比例打分，細胞無色為0，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；無陽性細胞0分，陽性細胞數<10%為1分，陽性細胞數10%～50%為2分，陽性細胞數>50%以上為3分。累計積分0～2分為陰性（－），3～4分為陽性（＋），5～6分為強陽性（＋＋）。

1.3 統計學方法 應用SPSS 11.5統計軟件進行數據處理，各組資料比較采用卡方（χ2）檢驗，不同指標相關性運用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果Grb-2陽性物質均定位于細胞核和（或）細胞漿中，見圖1。Ras陽性物質定位于細胞漿中，見圖2。P-ERK的陽性物質定位于細胞核和（或）細胞漿中，見圖3。CD-1陽性物質定位于細胞核中，見圖4。

2.2 Grb-2、Ras、P-ERK及CD-1在子宮內膜組織中的表達情況Grb-2、P-ERK和CD－1在3組間陽性表達率差異有統計學意義（P＜0．05或P＜0．01）；Ras在3組間陽性表達率差異無統計學意義（P＞0．05），見表1。

表1 3組患者子宮內膜組織中Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1的陽性表達情況 （例）

2.3 Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1表達與血清胰島素以及各指標的相關性Grb-2、P-ERK表達與血胰島素水平呈正相關（P＜0．05）。Ras、CD－1表達與血胰島素水平無相關性（P＞0．05）。Grb－2與Ras、P－ERK表達呈正相關，差異有統計學意義（P＜0．05），與CD－1無明顯相關性（P＞0．05），見表2。

表2 Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1與血清胰島素以及各指標的相關性 （r）

2.4 不同子宮內膜癌患者Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1表達情況 見表3。腫瘤的不同病理分期Grb-2和P－ERK的陽性表達差別有統計學意義（P＜0．01），Ⅱ～Ⅳ期陽性率高于Ⅰ期。在有無淋巴結轉移的子宮內膜癌中Grb－2陽性表達比較差別有統計學意義（P＜0．05）。其余各指標與其他臨床病理因素差別無統計學意義（P＞0．05）。

3 討論

胰島素除調節物質代謝外，還可作為生長因子家族中的一員，調控細胞的增殖與凋亡。胰島素在腫瘤生長調控中存在2條信號傳導機制：PI3K-Akt及Ras-MAPK通路。本課題組前期研究證實子宮內膜癌細胞及組織存在胰島素受體（IR）表達與活化，通過其下游的PI3K-Akt通路參與腫瘤細胞增殖與凋亡[1-2]。但Ras-MAPK途徑研究較少，尤其是在腫瘤組織中的研究，胰島素與IR結合后，激活的IR可直接使Shc的酪氨酸殘基磷酸化，Shc再與Grb－2結合，經GDP－GTP交換因子激活Ras，進而激活Raf－1激酶、MAPK的激酶（MAPKK，也稱MEK），MAPKK磷酸化后激活MAPK。MAPKs家族包括3個亞族：ERKs、JNKs和p38MAPKs。活化的MAPK可使許多靶蛋白磷酸化，引起多種癌基因及細胞周期調控蛋白CyclinD1等相繼激活，促進細胞分裂[3]。

Grb-2是生長因子-Ras信號傳導途徑中的一個關鍵接頭分子，是Ras上游通路的重要組成部分。Yu[4-5]等研究發現大腸癌轉移灶較原發灶癌組織高表達基因有190條，其中轉移灶高表達的基因中Grb-2的差異最為明顯，達70倍，Grb-2與腫瘤的生長、浸潤、遠處轉移密切相關。本研究顯示，子宮內膜癌Grb-2陽性表達率升高，表明子宮內膜癌存在胰島素受體信號傳導通路下傳的基礎，Grb-2的高表達與子宮內膜癌的發生有關系。在不同病理分期及有無淋巴結轉移的子宮內膜癌中Grb-2的陽性表達比較差異有統計學意義，提示Grb-2參與子宮內膜癌的生長、浸潤及轉移。

表3 子宮內膜癌組織中Grb-2、Ras、P-ERK和CD-1陽性表達與臨床病理學特征的關系 （例）

Ras癌基因為原癌基因,Ras癌基因的激活是腫瘤發生的早期事件。本研究中Ras過度表達與各臨床病理因素無關，與本課題組成員于1997年的報道相同[6]。ERKs為MAPK家族重要成員。Mueller等[7]研究顯示P-ERK在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，P-ERK高表達與淋巴結轉移、復發有關。本實驗顯示：P-ERK在子宮內膜癌組織中呈現過表達，且不同病理分期間比較，差異有統計學意義，提示P-ERK可能參與子宮內膜癌的發展過程。目前認為，CD-1可驅動細胞由G0期進入S期，促進細胞增殖。而當CD-l表達失控時，則將引起細胞增殖周期失調，從而導致腫瘤發生。Choudhury等[8]研究顯示子宮內膜癌CD-1表達陽性率明顯高于單純性增生子宮內膜，與本試驗結果相同。

子宮內膜癌三大高危因素肥胖、糖尿病、高血壓，多囊卵巢綜合征（PCOS）患者是年輕子宮內膜癌的高危人群。而這些疾病共同的病理生理基礎為胰島素抵抗和高胰島素血癥，提示胰島素與子宮內膜癌的發生有關。本研究中血胰島素水平與Grb-2、PERK呈正相關。Grb-2可直接或間接地與生長因子受體或其相連接的蛋白質發生相互作用。葉韻斌等[10]研究表明P-ERK的活化需要Grb-2的參與。本研究中子宮內膜癌Grb-2與Ras、P-ERK蛋白表達呈正相關，說明Grb-2、Ras、P-ERK的過表達在子宮內膜癌中具有一致性，進一步證明胰島素-Ras-MAPK通路在子宮內膜癌的發生發展中具有重要作用。理論上MAPK活化后，進一步誘導CyclinD1的表達和活化，但本研究中Grb-2、Ras、PERK均與CD-1蛋白表達無相關性，推測CD-1過表達除受胰島素-Ras-MAPK通路的調節外，還受其他因子的調節。

本研究揭示了胰島素信號傳導通路在參與子宮內膜癌發生、進展中的重要作用，為子宮內膜癌靶向治療提供了理論依據。但胰島素-Ras-MAPK信號通路還包括哪些重要的信號因子、在子宮內膜癌中與PI3K-Akt信號通路的協同作用均有待于進一步的研究。

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[2]華紹芳,薛鳳霞,趙敬.磷脂酰肌醇3激酶通路在胰島素調節子宮內膜癌細胞增殖凋亡中的作用[J].中國實用婦科與產科雜志,2007,23(11):843-845.

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