HMGB1對HTLV-1病毒Tax蛋白表達的T細胞中NF-κB活性的影響①

劉蘇慧 牛志國 李俊英 胡新攀 趙玲玲 范勇利 陳麗媛 王 輝

(新鄉醫學院醫學檢驗系,新鄉453003)

高遷移率組蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)是一種存在于真核生物細胞內的非組蛋白染色體結合蛋白[1],許多研究證實HMGB1作為一種炎癥介質和致炎細胞因子,是啟動和維持炎癥級聯放大效應的中心分子,與多種腫瘤、關節炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、多器官功能障礙綜合征等發病機制關系密切,已成為近年危重醫學研究的熱點之一[2]。而Tax蛋白是由成人T淋巴細胞1型病毒(human T-cell lymphotropic virus type1,HTLV1)的tax基因編碼,在成人T淋巴細胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)發病早期起關鍵作用,研究已經表明Tax蛋白可以促進NF-κB的持續活化最終導致HTLV-1型病毒感染細胞最終發展為ATL細胞,這可能是ATL發病的主要機制[3]。為了研究作為重要炎癥因子的HMGB1是不是與ATL的發病相關,為此我們準備構建HMGB1的真核表達載體并研究其與Tax及NF-κB之間的關系,以期為ATL的發病甚至臨床檢測治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系與質粒 人CD4+T淋巴細胞系Jurkat E6-1細胞系購自美國ATCC公司;大腸桿菌DH5α由本室保存;TaxN及TaxP細胞系為本研究中心建立[4];pNF-κB-luc報告基因質粒為美國NIH欒好江博士惠贈;pcDNA3.0空質粒為新鄉醫學院千新來教授惠贈。pCMV-βGal質粒購自Promega公司。

1.1.2 主要試劑 熒光素報告基因檢測試劑盒、βGal檢測試劑盒購自 Promega公司;Trizol試劑、Taq酶、DNA MarkerⅠ和Ⅲ、質粒提取試劑盒均購自北京天根公司;反轉錄酶(M-MLV)、T4連接酶、各種限制性內切酶均購自TaKaRa公司;PCR及DNA回收純化試劑盒、質粒DNA提取純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、ECL發光試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司;兔抗人HMGB1、p65、GAPDH 抗體及HRP標記羊抗兔二抗均購自碧云天生物公司;所用引物(見表1)均為上海英駿生物公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 人HMGB1真核表達載體的構建 Trizol試劑提取生長狀態良好的Jurkat E6-1細胞總RNA,RTPCR擴增HMGB1的開放性閱讀框全長片段,退火溫度58℃;HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后純化的HMGB1片段與pcDNA3.0雙酶切產物連接,16℃過夜后轉化感受態DH5α。挑取陽性菌落增菌,菌液PCR(退火58℃)篩選,提取質粒雙酶切,同時送上海英駿生物公司測序。

1.2.2 RT-PCR檢測HMGB1、p65及Tax基因mRNA的表達 將pcDNA3.0-HMGB1轉染TaxN細胞(TNH組)和TaxP細胞(TPH組),對照組TaxN細胞(TaxN組)和TaxP細胞(TaxP組)轉染pcDNA3.0空質粒,質粒均為0.5μg,轉染方法詳見文獻[4],培養48小時后提取細胞的總RNA,RT-PCR檢測HMGB1、p65、Tax及GAPDH的 mRNA的表達,退火 HMGB1為58℃,p65為57℃,Tax為56℃。電泳圖片用 Band leader 3.0進行灰度分析,以目的片段條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反應目的基因的表達量。

1.2.3 Western blot檢測HMGB1及p65蛋白的表達 將pcDNA3.0-HMGB1轉染TaxN細胞(TNH組)和TaxP細胞(TPH組),對照組TaxN細胞(TaxN組)和TaxP細胞(TaxP組)轉染pcDNA3.0空質粒,質粒均為0.5μg,轉染方法詳見文獻[4],培養48小時后提蛋白,Western blot檢測HMGB1蛋白及p65蛋白表達 ,一抗均 1∶1 000稀釋,4℃過夜,二抗 1∶600 稀釋,室溫孵育1.5小時,ECL發光。所得膠片經掃描后用Quantity one4.6.2進行分析,以目的片段條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映目的基因的表達量。

1.2.4 熒光素酶檢測NF-κB活性 陽性組將pcDNA3.0-HMGB1和pNF-κB-luc共轉染TaxN和TaxP細胞,陰性組共轉染 pcDNA3.0和pNF-κB-luc質粒,以TaxN細胞共轉染pcDNA3.0和pGL3-Basic-luc質粒為空白組,同時共轉染pCMV-βGal質粒作為內對照,每種質粒轉染量均為0.25μg,培養48小時后,1 000 r/min離心5分鐘搜集細胞,PBS洗滌2次后,加入250μl Reporter Lysis Buffer,室溫放置 15分鐘,4℃1 000 r/min離心5分鐘,收取20μl上清細胞裂解液置于測定管中,加入100μl熒光素酶反應底物,在熒光分析儀(20/20 nluminometer)測定發光強度,檢測時間為20秒。陽性組及陰性組數據與空白組的比值表示熒光素酶相對活性。同時將裂解液用酶標儀檢測βGal的表達作為內對照對熒光素酶數值進行校正。

2 結果

2.1 pcDNA3.0-HMGB1表達載體成功構建 HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切得到一條648 bp條帶,HindⅢ和BamHⅠ雙酶切得到一條271 bp條帶,BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切得到一條377 bp條帶,均與預期分析的結果一致(圖 1);測序結果與NCBI上查詢的HMGB1開放性閱讀框序列100%匹配,提示構建正確(圖2)。

表1 PCR引物序列Tab.1 Oligonucleotide primers used in PCR for detection of gene transcripts

2.2 HMGB1促進p65基因mRNA的表達 通過RT-PCR檢測顯示,TaxP細胞中HMGB1的表達要強于TaxN細胞,并且轉染pcDNA3.0-HMGB1的TaxN細胞和TaxP細胞中HMGB1mRNA的表達均增強,而Tax的mRNA只在TaxP細胞中檢測到(圖3),通過半定量 PCR檢測 p65發現,在轉染有pcDNA3.0-HMGB1的TaxP細胞(TPH)中PCR第24個循環就可見有條帶,而沒有轉HMGB1表達質粒的在第28個循環才有條帶,轉染有HMGB1表達質粒TaxN細胞(TNH)雖然條帶和沒有轉染HMGB1表達質粒的TaxN細胞都是在第28個循環出現條帶,但TNH的條帶明顯比TaxN的條帶亮(見圖 4),從而說明HMGB1對p65的表達有促進作用。

圖1 限制性酶切分析pcDNA3.0-hHMGB1Fig.1 Restriction analysis of recombinant plasmid pcDNA3.0-hHMGB1

圖2 陽性克隆插入片段的測序結果Fig.2 The inserted fragments of positive colonies were analyzed by sequencing

2.3 HMGB1促進細胞內p65蛋白的表達 通過Western blot檢測發現,pcDNA3.0-HMGB1轉染TaxN細胞和TaxP細胞后p65蛋白的表達高于沒有轉染HMGB1對照組,且TPH組p65蛋白的表達也高于TNH 組(見圖 5、6)。

2.4 HMGB1能夠活化NF-κB通路 pcDNA3.0-HMGB1和 pNF-κB-luc共轉染 48小時后,TaxP細胞組熒光素酶相對活性均值均明顯高于對應的TaxN細胞組的(P＜0.05,P＜0.05);且TPH組NF-κB活性也明顯高于TNH組(P＜0.05),且對于TaxN細胞和TaxP細胞轉染pcDNA3.0-HMGB1后NF-κB活性明顯高于相應對照組(P＜0.05)。見圖7。

圖3 RT-PCR檢測 HMGB1和 Tax的mRNA表達Fig.3 HMGB1 and Tax mRNA levels detected by RT-PCR

圖4 RT-PCR檢測p65的mRNA表達Fig.4 p65 mRNA levels detected by RT-PCR

圖5 Western blot檢測 HMGB1和p65蛋白Fig.5 The proteins of HM GB1 and p65 detected by Western blot

圖6 HMGB1蛋白和p65蛋白與GAPDH蛋白的比較Fig.6 Comparison of HMGB1 and p65 protein levels in Gray value with GAPDH

圖7 TaxN細胞和TaxP細胞的熒光素酶活性Fig.7 Activity of luciferase in TaxP and TaxN cells

3 討論

HMGBl作為重要的晚期炎癥介質,目前已經進行了多方位的研究[5]。然而,HMGB1對腫瘤細胞的生物學影響及機制,尚待探討。在一些腫瘤,如非小細胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、前列腺癌等發生時都有HMGB1過表達的出現,其配體RAGE在腫瘤的發生中也出現高水平,RAGE進一步觸發信號機制,激活細胞內的 p38、MAPK及NF-κB等信號通路,正如當前研究所表明的,HMGB1與腫瘤的發生、發展、新生血管的形成和腫瘤細胞的生長、浸潤、轉移、增殖、凋亡及耐藥的形成等密切相關[6-11]。那HMGB1會不會與ATL發病甚至治療相關呢?

研究已經證明,HTLV-1主要侵犯人CD4+T淋巴細胞,HTLV-1型病毒的tax基因編碼的Tax蛋白在病毒侵犯T細胞后可明顯促進其活化并最終導致病毒感染細胞轉化為ATL細胞,所以我們選用本實驗室夏云等構建的人CD4+的Tax陰性的TaxN細胞和CD4+的Tax陽性的TaxP細胞作為研究對象,研究Tax、HMGB1、NF-κB 的關系。本實驗表明TaxP細胞HMGB1的mRNA和蛋白的表達明顯高于TaxN細胞,NF-κB活性也明顯高于 TaxN 細胞,另外 NF-κB亞基p65的mRNA和蛋白表達也明顯高于TaxN細胞,分析也提示NF-κB活性和HMGB1表達呈正相關,這提示Tax作為HTLV1型病毒編碼的重要蛋白,可以導致CD4+T細胞活化,這與國外及本實驗室報道相一致,同時活化后的T細胞HMGB1表達高于Tax陰性的 TaxN細胞,這提示 Tax可以促進HMGB1的表達,但是由于Tax蛋白主要存在于早期病毒感染的細胞,而60%病人的ATL細胞并不能檢測到Tax蛋白的存在,所以Tax蛋白促進HMGB1的表達應該在病毒感染早期即炎癥階段,表達的HMGB1一方面被釋放至胞外,可能通過自分泌和(或)旁分泌作用于自身或鄰近的T細胞,并于T細胞膜表面的RAGE、TLR4、TLR2結合進而刺激NF-κB的活化,活化的NF-κB可促進炎癥介質的釋放,而炎癥介質的釋放必將正反饋地導致NF-κB的持續活化[12],另外高表達的HMGB1作為核內的一種非組蛋白,可以通過與雙鏈螺旋狀DNA的小溝結合穩定DNA結構,使得病毒感染細胞存活期延長,最終使得病毒感染細胞發展為ATL細胞[11]。由于HMGB1蛋白和NF-κB的正相關,而從實驗結果中也可以看出,轉染HMGB1表達載體后的TaxP細胞(TPH)中的NF-κB通路的活化要比TaxN細胞(TNH)的強,因此我們認為在HTLV-1感染的T細胞中HMGB1可能協同Tax蛋白激活NF-kB通路從而參與ATL疾病的發生。實際上,Yanai等發現在Hmgb1-/-和Hmgb2-/-小鼠細胞中,由定向激活胞漿核苷酸反應受體的DNA或RNA誘導產生的Ⅰ型IFNs和炎癥細胞因子受損,三種HMGB蛋白表達均受抑制的細胞受損更嚴重,同時伴有轉錄因子IRF3,NF-kB的受損激活。HMGBs蛋白的缺失嚴重影響TLR3、TLR7、TLR9被其同源核苷酸的激活。這些結果說明,在核苷酸介導激活的免疫應答體系中,核苷酸反應受體的選擇性激活取決于HMGBs與核苷酸這間的反應,本實驗的結果與之相符合[13]。

盡管Tax可以促進HMGB1表達,但是HMGB1在ATL發病中究竟扮演什么角色仍需要進一步研究。

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3 Peloponese JM Jr,Yasunaga J,Kinjo T et al.Peptidylproline cis-trans-isomerase Pin1 interactswith human T-cell leukemia virus type 1 tax and modulates its activation of NF-kappaB[J].J Virol,2009;83(7):3238-3248.

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13 Yanai H,Ban T,Wang Z et al HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses[J].Nature,2009;462(7269):99-103.