STAT3siRNA對肺腺癌A549細胞STAT3表達和細胞生物學行為的影響①

張 潔 羅麟潔 徐麗娜 房 潔 王鴻程 (瀘州醫學院附屬醫院呼吸科,瀘州646000)

肺癌是當今世界上嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一。肺癌的發病機制還不十分明確,尚沒有靈敏、特異的診斷方法和有效的治療手段。美國著名腫瘤學家R.Peto預測如果我國吸煙和空氣污染不即時控制,到2025年我國每年肺癌將超過100萬,成為世界第一肺癌大國[1]。肺癌的發生與發展與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關。STAT3是一種癌基因,有強烈的抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的作用,參與了人類惡行腫瘤的發生、發展。它本身并不直接引起癌變,而是通過激活其靶基因產物的表達來影響腫瘤的發生,STAT3的下游靶基因都與細胞增殖、凋亡密切相關,如 Bcl-XL、B細胞淋巴瘤 /白血病基因-2(Bcl-2)、Mcl-1、細胞周期素 D1(Cyclin D1)、c-Myc、c-Jun、Fas、VEGF 等[2]。提示阻斷STAT3信號轉導通路可能起到有效的抗腫瘤作用。本課題組前期實驗結果證實,肺腺癌組織中存在持續性激活的STAT3。本研究擬利用RNA干擾技術阻斷STAT3激活,檢測下游分子STAT3、CyclinD1、BAX、Bcl-2 、Caspase-9 的表達,觀察其誘導腫瘤細胞產生、生長抑制和凋亡效應,了解STAT3作為肺癌治療新分子靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞株A549由四川大學華西醫院呼吸科實驗室提供;DMEM(高糖)培養基、胎牛血清為美國Gibco公司產品;Opti-MEMI為美國Invitrogen 公司產品 ;兔抗人 STAT3、Bcl-2、CyclinD1、BAX、Caspase-9多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體購自廣東中杉公司。

1.2 siRNA的制備 根據siRNA的設計原則,設計三段STAT3特異shRNA基因序列,由廣州銳博生物公司采用化學合成法合成三條雙鏈siRNA,基因序列見表1。

1.3 細胞培養及基因轉染 A549細胞用含10%小牛血清的DMEM培養基,于37℃、5%CO2環境下培養,分別轉染三種siRNA,即siRNA1組(sihSTAT3-1組)、siRNA2組 (sihSTAT3-2組)、siRNA3組 (sih-STAT3-3組),并設陰性對照組(Non-Control-脂質體陰性對照組)、陽性對照組(sih GADPH組)、空白對照組(Non-Control-血清空白對照組)、熒光對照組(Non-Control-FAM熒光對照組)及各組相對應內參對照組 (β-actin組)。將細胞以1×104個/0.5 ml的密度接種到24孔培養板,37℃孵育培養1～2天,使每孔的細胞密度達到30%～50%。轉染前1天,使用Opti-MEMI培養基(使細胞在轉染時達到90%～95%的融合),分別用Opti-MEMI培養基稀釋FAM-siRNA和Lipofectamine2000,FAM-siRNA按1.25μl/孔的濃度稀釋,Lipofectamine2000按1μl/孔的濃度稀釋,稀釋好的Lipofectamine2000經室溫孵育5分鐘后與稀釋好的FAM-siRNA輕輕混合,室溫放置20分鐘以形成FAM-siRNA-lipo2000復合物,將該混合物加入培養板中,輕晃混勻,在 37℃、5%CO2溫箱孵育,4～6小時更換完全培養基。轉染siRNA后16小時用熒光顯微鏡觀察FAM熒光,并于轉染后24、48、72小時收集其他各組細胞備用。

1.4 RT-PCR法檢測A549細胞STAT3mRNA表達水平 轉染后24小時收集細胞,按試劑盒說明分別提取各組細胞的RNA,逆轉錄合成相應cDNA,用Taq DNA聚合酶擴增STAT3。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。依據目的基因PCR產物與β-actin基因PCR產物灰度比,判斷靶基因的mRNA被siRNA沉默的程度。STAT 3-siRNAs對STAT 3mRNA表達的抑制率:抑制率(%)=(1-干擾組STAT 3mRNA相對含量/陰性對照組STAT3mRNA相對含量)×100%。PCR引物如下:STAT3 的上游引物 5′-GAGGAGGCATTCGGAAAG-3′,下游引物 5′-TCGTTGGTGTCACACAGAT-3′;β-actin 上游引物 5′-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3′,下游引物5′-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3′;GAPDH 上游引物5′-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3′,下游引物 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

1.5 Western blot法檢測A549細胞STAT3蛋白表達水平 轉染STAT3siRNAs 48小時后收集細胞,提取細胞總蛋白,樣品蛋白經SDS-PAGE電泳分離后電轉移到PVDF膜上,經5%脫脂奶粉封閉過夜。加入兔抗人STAT3抗體,孵育 1.5～2小時。TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體,孵育1小時,TBST洗膜。熒光顯色,加入Lurriglo Keageut試劑A、B液,反應15～30分鐘。X片曝光,拍照。

1.6 AM-BLUE法檢測細胞增殖反應 轉染STAT3siRNAs后收集細胞,分別加入AM-BLUE試劑,孵育2～6小時,收集細胞,制成密度為 1×104ml-1的細胞懸液,接種到96孔培養板中,分為干擾組 siRNA1 組 、siRNA2 組 、siRNA3 組 、陰性對照組 、陽性對照組、空白對照組 6組,每組6個復孔。在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養 1天,待細胞貼壁,換為Opti-MEMI培養基培養1天,然后按siRNA 0.25μl/孔,Lipofectamine2000 0.25μl/孔的濃度進行轉染。于轉染后24、48、72小時分別向每孔加入10 μl AM-BLUE,在細胞箱孵育 2～6小時后,用酶聯免疫檢測儀進行檢測,在570nm波長測定各孔吸光度,參考光波長 600 nm,實際的吸光度讀數=OD570 nm-OD600 nm;并計算藥物對細胞的抑制率。抑制率(%)=(空白對照組的OD值-干擾組的OD值)/空白對照組的OD值×100%。

表1 三段STAT3特異性siRNA序列Tab.1 Sequences of siRNA for STAT3 gene

1.7 流式細胞術(flow cytometer,FCM)檢測細胞凋亡 轉染STAT3siRNAs后48小時收集各組細胞,PBS洗滌重懸,調整細胞密度為(1×106～2×106)個/ml。加入Annexin-V-FITC和PI,避光室溫反應后用流式細胞儀檢測并分析結果計算凋亡率。

1.8 統計學分析 實驗數據用SPSS10.0統計軟件進行分析。測定值以±s表示,采用單因素方差分析和Person相關分析。P＜0.05有統計學意義,P＜0.01為顯著差異。

2 結果

2.1 siRNA-STAT3轉染效率檢測 用脂質體2000轉染siRNA-STAT3于A549細胞16小時后,用熒光顯微鏡觀察,可見FAM分散在胞質中,說明轉染成功,見圖1。

2.2 轉染siRNA-STAT3對A549細胞STAT3基因沉默效率 轉染siRNA-STAT3 24小時后,可使A549細胞STAT3表達受到抑制,較陰性組和空白組A549細胞明顯降低(見圖2A),但其抑制率各不相同,siRNA1、siRNA2和siRNA3的抑制率分別為(85.8±1.4)%、(88.9±1.1)%和(86.8±0.9)%,其中 siRNA2作用最為明顯(見圖2B),因此,選擇此序列作為目的序列進一步研究。

2.3 轉染 siRNA-STAT3對A549細胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表達的影響 干擾組與陰性對照組,干擾組與空白對照組STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白相對表達水平均有顯著差異。其中干擾組STAT3、CyclinD1、Bcl-2蛋白相對表達水平較陰性對照組和空白對照組明顯降低,差異具有統計學意義(P＜0.05),干擾組細胞中BAX、Caspase-9蛋白相對表達水平較陰性對照組和空白對照組明顯升高,差異具有統計學意義(P＜0.05),但 STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白相對表達水平陰性對照組與空白對照組無顯著差異(P＞0.05),β-actin表達量在各組之間無顯著性差異(P＞0.05),見圖3。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉染效率(×200)Fig.1 Observed transfection efficiency under fluorescence microscope(×200)

圖2 轉染各組A549中STAT3 mRNA的表達Fig.2 STAT3 mRNA expression of cells in different group after siRNA transfection

圖3 siRNA-STAT3轉染后48小時 A549細胞蛋白表達Fig.3 Protein expression after siRNA transfection in the A549 cells

表2 STAT3基因表達對 A549細胞 CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9表達影響的相關性Tab.2 The correlation between the expression of STAT3 and CyclinD1,Bcl-2,BAX and Caspase-9 in A549 cells

圖4 轉染siRNA-STAT3對A549細胞增殖的影響Fig.4 Effect of siRNA-STAT3 on proliferation of A549 cells

2.4 轉染 siRNA-STAT3沉默STAT3基因表達對A549細胞 CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表達的相關性 siRNA2沉默A549細胞STAT3基因后,STAT3蛋白表達與CyclinD1蛋白表達及Bcl-2蛋白表達間呈正相關,具有統計學意義(P＜0.05),STAT3蛋白表達與Bcl-2蛋白表達呈負相關,具有統計學意義(P＜0.05)。STAT3蛋白表達與Caspase-9蛋白表達無相關性(P＞0.05),見表2。

2.5 轉染siRNA-STAT3對A549細胞增殖的影響 細胞生長抑制率曲線圖顯示,STAT3基因沉默可以明顯抑制A549細胞的生長,干擾組(siRNA1、siRNA2、siRNA3)分別在轉染后24、48、72小時隨著時間延長對細胞增殖的抑制率明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.05)。干擾各組與陰性對照組抑制率明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.05),見圖4。

2.6 轉染siRNA-STAT3對A549細胞凋亡的影響轉染后48小時,siRNA1、siRNA2、siRNA3轉染組,陰性對照組,空白對照組A549細胞凋亡率分別為(67.09±11.25)%,(70.61±14.46)%,(68.91±12.16)%,(26.64±11.81)%和(21.58±12.91)%,siRNAs組的凋亡率明顯高于陰性對照組、空白對照組(P＜0.05)。

3 討論

蛋白酪氨酸激酶(Jauns激酶,JAK)可使STAT磷酸化,并激活STAT蛋白,激活前的STAT蛋白屬于胞漿蛋白,而活化后的STAT則以同源或異源二聚體形式移位到胞核,在靶基因的啟動區與特定的DNA元件結合,發揮其生物學活性。我們前期研究中發現,STAT3蛋白在肺癌組織中有異常高表達,較正常組織顯著增高[3]。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號途徑的匯聚點,因此,理論上講,阻斷腫瘤細胞STAT3信號傳導通路就有可能起到治療腫瘤的作用。王新華等[4]發現,應用小干擾RNA沉默人食管鱗癌細胞株STAT3基因,STAT3蛋白核結合活性下降,阻斷了STAT3信號的持續激活,使細胞周期停滯于G0/G1期,細胞增殖受到明顯抑制。Ren等[5]發現,在穩定表達STAT3的膠質瘤細胞中,干擾STAT3表達,可促進細胞凋亡。RNAi是一種序列特異的雙鏈RNA分子。其在mRNA水平關閉相應序列基因的表達或使其沉默的過程,即siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子,從而實現基因敲除。siRNA研究中采用的方法有化學合成法、質粒或病毒載體法、體外轉錄法、長片段雙鏈RNA切割法、PCR制備的siRNA表達框架體系等。本課題組曾成功構建了Psuper-siRNA-STAT3重組質粒,轉染A549細胞可有效降低STAT3mRNA水平,最大干擾效率達85.32%[6]。本實驗采用化學合成法得到siRNA,此種方法方便簡單,易標記siRNA以追蹤其在體內的活動狀況,能夠滿足我們實驗設計的需要。實驗結果顯示,siRNA沉默A549細胞STAT3基因表達后,STAT3siRNAs能在mRNA和蛋白質水平顯著降低STAT3的表達,對STAT3蛋白表達的抑制率達73.8%,同時,CyclinD1、Bcl-2蛋白表達明顯減少,BAX、Caspase-9蛋白表達顯著增加;細胞增殖受到明顯抑制,凋亡率顯著增加。上述結果提示,用RNA干擾技術阻斷STAT3的表達,可同時抑制多個癌基因的表達,對抑制肺癌細胞的生物學行為,抑制腫瘤生長起到協同作用,為抗STAT3基因治療提供了實驗和理論依據。同時提示,針對肺癌的靶向治療時,單一靶向治療效果如不滿意,可同時聯合多個靶向治療。靶向治療將成為治療肺癌的新方向。

1 朱元玨,陳文彬.呼吸病學[M].北京:人民衛生出版社,2003:1011-1012.

2 Imada K,Leonard W.The Jak-STAT pathway[J].Mol Immunol,2000;37(1-2):1-11.

3 閆凌麗,王鴻程,朱 晨.STAT3信號轉導途徑在肺腺癌細胞中的表達活化[J].細胞與分子免疫學雜志,2009;25(2):141-142.

4 王新華,李珊珊,閻愛華 et al.小干擾RNA阻斷信號轉導子3信號對人食管鱗癌細胞株增值的抑制作用[J].中國病理學雜志,2007;36(6):379-383.

5 Ren W,Duan Y,Ji Y et al.Down-regulation of STAT3 induces apoptosis of human glioma cell:a potential method to treat brain cancer[J].Neurol Res,2008;30(3):297-301.

6 孫紹娟,王鴻程,許學亮 et al.RNA干擾技術沉默STAT3對人肺腺癌細胞生長抑制作用的研究[J].腫瘤防治研究,2007;34(8):565-567.