同型半胱氨酸血癥對大鼠骨折愈合的影響

秦晉峰，李金庫

（1.山西醫科大學公共衛生學院，山西太原 048205；2.山西省晉煤集團總醫院寺河分院，山西晉城 048006）

高同型半胱氨酸血癥（HHCY）是一個廣泛的代謝問題，被認為是心血管疾病與骨質疏松癥的危險因素[1-2]。老年人患有高同型半胱氨酸血癥主要與缺陷的維生素B6、維生素B12、葉酸以及腎功能不全有關[2-5]。

近年研究表明，患有同型半胱氨酸血癥的患者骨質疏松癥和骨質疏松性骨折的發病率較高[6-7]。體外研究表明，同型半胱氨酸（HCY）能夠刺激破骨細胞的擴散和成骨細胞的凋亡[8-12]。這可能對其他組織向骨組織的轉化有不利影響，正如臨床實驗中對骨代謝的血清學標志物分析結果所示。

雖然已經證實同型半胱氨酸血癥是骨質疏松癥和骨質疏松性骨折的一個新的危險因素，但并不能說明這些代謝改變也影響骨折愈合。在高同型半胱氨酸的血藥濃度下，破骨細胞的非生理增殖可能影響骨折愈合過程。因此，本實驗假設同型半胱氨酸飲食所致的高同型半胱氨酸血癥與骨折修復受損有關。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

實驗組 SD大鼠（體重 300～400 g，12只），分別喂同型半胱氨酸，并補充標準飲食。基于先前的一項大鼠數據研究[10]，大鼠喂養同型半胱氨酸，給予標準飲食3周之后制作股骨骨折模型。對照組以標準飲食喂養，3周后制作股骨骨折模型。根據對大鼠骨折愈合的研究，造模4周后處死動物，制作骨折標本并進行放射性學、組織形態學和生物力學分析。此外，采集血液樣品，評價兩組大鼠同型半胱氨酸的血藥濃度。

1.2 造模

大鼠腹腔注射二甲苯胺噻嗪（25 mg/kg）及氯胺酮（75 mg/kg）進行麻醉。每只大鼠用三點壓力裝置造成右股骨骨折模型并用髓內釘固定，通過骨折碎片之間的壓力在軸向與抗旋上保持骨折在術后的穩定性。根據AO原則，骨折類型為股骨干骨折A2～A3型。

1.3 血清同型半胱氨酸濃度分析

處死前，行下腔筋脈穿刺獲取血液樣品，放置30 min后用離心機離心分離出血清。血清標本于-80℃存放等待分析。使用氣相色譜質譜法測定同型半胱氨酸的血藥濃度。區域內和區間變異系數分別為3.2%和6.7%。

1.4 生物力學測試

取出髓內釘后，大鼠股骨固定于三點彎曲裝置。三點彎曲裝置以恒速為1 mm/min、最大10 N的背轉力作用于鼠股骨中心（骨折水平處）。連續監測負載和股骨形變，并繪制出負載-形變曲線。

1.5 組織形態學觀察

在組織形態測試中，未脫鈣股骨固定于4%中性甲醛溶液中，并用乙醇脫水，最后用聚甲基丙烯酸甲酯包埋。然后沿矢狀平面做薄切片（7 μm），并用甲苯胺藍-亞甲藍染色。組織切片在200倍光學顯微鏡下觀察。股骨中部與邊緣為被觀測區域，觀測目標包括骨、軟骨、結締組織和骨髓。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 X線分析

X線顯示，4周內實驗組大鼠與對照組大鼠內置物與骨折端無明顯移位，并且骨折縫隙減少，兩組大鼠骨折處均有骨痂形成。

2.2 血清同型半胱氨酸濃度分析結果

喂食同型半胱氨酸補充飲食的實驗組大鼠同型半胱氨酸血藥濃度為（102.2±64.5）μmol/L，與標準飲食的對照組的（2.8±1.5） μmol/L 比較，差異有高度統計學意義（P＜0.001）。兩組大鼠活躍度與體征差異無統計學意義（P＞0.05），組間個體體重差異無統計學意義（P＞0.05）。術后3 d所有個體均活動自如，行動不受限。

2.3 生物力學分析結果

骨折后4周，實驗組大鼠愈傷組織的抗彎剛度為（45.5±18.2） N/mm，與對照組的（64.6±15.8） N/mm 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 組織形態學分析結果

在骨折愈合的4周內所有樣本顯示出典型的骨折愈合模式。增生組織以編織成骨為主，并且喂食同型半胱氨酸補充飲食的實驗組大鼠骨痂生成的直徑小于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。對照組大鼠中沒有發現纖維軟骨，但在實驗組中有2只出現纖維軟骨(表1)，表明在骨愈合和改建過程中這2只大鼠要慢于沒有表達纖維軟骨的大鼠。

表1 組織形態學分析（）

表1 組織形態學分析（）

指標 實驗組 對照組愈傷組織直徑（mm）2.0±0.32.3±0.5愈傷組織面積（mm2）2.1±0.91.8±0.8組織構成骨組織（%）41.9±11.544.1±19.3軟骨組織（%）0.9±1.60.0±0.0纖維組織（%）56.8±10.956.1±19.5

3 討論

實驗結果驗證了本研究的假說，即同型半胱氨酸飲食與骨折愈合之間存在關聯。血清分析結果證明同型半胱氨酸飲食可導致高半胱氨酸血癥。大鼠喂食同型半胱氨酸引起嚴重的高半胱氨酸血癥[5]，實驗組同型半胱氨酸血清濃度為（102.2±64.5）μmol/L，約為對照組[(2.8±1.5)μmol/L]的 40倍。 迄今為止，只有少數研究使用動物模型分析同型半胱氨酸血癥對骨代謝的影響。通過給大鼠喂食甲硫氨酸等[8]使其同型半胱氨酸血清濃度上升到16 μmol/L，形成溫和的同型半胱氨酸血癥[5]。Herrmann等[9]通過給大鼠喂食甲硫氨酸與標準飲食，可使大鼠同型半胱氨酸血清濃度達到（27.0±8.8）μmol/L，從而也形成溫和的同型半胱氨酸血癥。這項實驗結果表明，同型半胱氨酸血癥組骨折愈合組織的面積和股骨的力學強度比對照組大鼠都有不同程度的降低；也說明大鼠骨折愈合與血清高濃度同型半胱氨酸的相關性。另一項動物實驗表明，在高同型半胱氨酸血癥大鼠的骨組織中有同型半胱氨酸累積，并且其骨密度降低[10]。

最近在體外和體內的研究都表明，在骨吸收過程中同型半胱氨酸濃度升高[8-12]。此外，幾個橫斷面研究已經顯示出同型半胱氨酸濃度的升高和骨吸收的增加之間有明顯的聯系。體外研究證實在破骨細胞的活動中同型半胱氨酸含量增加[11]。另一方面，同型半胱氨酸血癥影響骨代謝仍然是一個有爭議的話題，因為其他研究否認同型半胱氨酸的血清濃度升高和增加骨質疏松性骨折的風險的關系。

同型半胱氨酸血癥影響骨祖細胞和成骨細胞的活動，兩者是骨折愈合過程中的關鍵細胞[1,12]。但是，關于這個問題的數據也是矛盾的。體外研究表明，低濃度的同型半胱氨酸可刺激成骨細胞，但據報道高濃度的同型半胱氨酸對成骨細胞有毒性作用[1]。

綜上所述，本實驗表明同型半胱氨酸飲食可導致嚴重的同型半胱氨酸血癥，擾亂了大鼠的骨修復。改變破骨細胞和成骨細胞的增殖和活性是否能導致這一結果，對伴有同型半胱氨酸血癥的骨折患者的治療非常重要。

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