PEG-EPO在大鼠體內的藥代動力學研究

鄭崛村，沈富兵，鄧念華，孟延發（.成都醫學院醫學檢驗系，四川 成都 60083； .四川大學生命科學院，四川 成都 60064）

重組人紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin, rhEPO）常用于治療慢性腎功能不全性貧血以及腫瘤化療、艾滋病毒感染、骨髓異常增生綜合征等引起的貧血。由于其體內半衰期只有6～9 h，臨床病人需每周注射3次才能達到治療效果，并且需要長期使用。為了減少病人的痛苦和治療費用，我們研制了聚乙二醇化重組人紅細胞生成素（PEG-rhEPO），即用聚乙二醇活性酯對rhEPO進行化學修飾，使PEG與rhEPO通過共價鍵結合而形成PEG-EPO，增加相對分子質量，并封閉部分蛋白酶作用位點，以便延長體內循環半衰期。同時，PEG在蛋白質表面具有遮蔽分子表面抗原決定簇的作用[1]，降低免疫原性,減少特異性抗體的產生，可提高藥物的穩定性[2-3]。迄今已有尿激酶、水蛭素、血紅蛋白、干擾素、白介素-2、粒細胞集落刺激因子等PEG化學修飾的蛋白藥物面世[4]。本文擬采用放射性標記法（125I標記PEG-EPO），研究PEG修飾的EPO在大鼠體內的藥代動力學，并獲取體內半衰期等主要藥代動力學參數，觀察PEG修飾后的長效效果及相應的動力學特征。

1 材料

1.1 藥品與試劑

基因重組CHO-EPO工程細胞株經大規模細胞培養和純化，獲得EPO，以分子量為20 KD的PEG對EPO進行修飾，并經分離獲得PEG-EPO，純度 ＞98%，11.5 mg·mL-1。臨用時，以0.9%氯化鈉注射液將原液稀釋至低、中、高劑量所需濃度。Iodogen（Sigma公司），Na125I（無還原劑，英國Amersham公司），三氯醋酸（江蘇如皋市化學試劑廠）。3 mm CHR層析紙（英國Whatman公司）。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠18只，雌雄各半，體重225～372 g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK（滬）-2003-0002。

1.3 儀器

FH463-A型自動定標器（北京核儀器廠）；BSZ-160型自動部份收集器（上海滬西儀器廠）；XH-6010A型全自動γ閃爍計數儀（西安262廠）；XHF-1內切式勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LDR4-8.4C低溫離心機（北京醫用離心機廠）；Sephadex（G-50，Pharmacia公司）。

2 測定方法的建立和驗證

2.1 125I-PEG-EPO的制備、純化、鑒定

2.1.1125I-PEG-EPO的制備 采用Iodogen法碘化標記PEG-EPO。125I-PEG-EPO的標記率在35%～38%之間，125I-PEG-EPO放射性比活度：176～192 Bq·ng-1。

2.1.2125I-PEG-EPO標記物的純化 采用Sephadex G-50凝膠柱層析過濾法。層析柱：10.0 mm×300 mm；淋洗液：0.05 mol·L-1PBS ( pH 7.4)。方法：將標記混合液上柱后，用淋洗液洗脫并分管收集洗脫液。分管測量洗脫液的放射性強度。收集125I-PEG-EPO峰（蛋白峰）的各管洗脫液混合即為本標記所得到的目標化合物125I-PEG-EPO。

2.1.3125I-PEG-EPO的質量鑒定 （1）放射化學純度測定：采用三氯醋酸沉淀法（TCA法）對標記物125I-PEG-EPO進行測定，平均放射化學純度為（97.08±1.44）% （n= 5），略高于紙層析法；放射性紙層析方法（PLC）用0.9%氯化鈉注射液作為展開劑，經紙層析分段測定得到放化純度，平均放化純度為（95.93±2.81）% （n= 5）。（2）125I-PEG-EPO貯存穩定性測試：分別在4 ℃和室溫（10～12 ℃）條件下，用TCA法測定在貯存不同時間后放射性標記物125I-PEG-EPO的放射化學純度；測量數據表明，125IPEG-EPO在4 ℃下保存5 d基本保持穩定，放化純度＞ 95%，在室溫下能存放24 h。結果見表1。

表1 125I-PEG-EPO放射化學純度的穩定性測試(TCA法)Tab 1 Stability measurement of radiochemical purity of 125IPEG-EPO (TCA)

2.2 大鼠全血PEG-EPO原型藥的分離

樣品加入2倍體積20%三氯醋酸，混勻，3000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀即為原型藥，測定沉淀的放射計數，根據校正曲線即可得到藥物濃度。

2.3 大鼠全血PEG-EPO測定的校正曲線

在方法驗證和藥物動力學試驗中均將PEGEPO設置為低、中、高3個劑量組，分別為3，9，27 μg·kg-1的靜脈注射劑量。PEG-EPO工作液（2.65×104cpm·μL-1）用大鼠空白全血制備放射性濃度為150，500，1000，5000，10 000，50 000，100 000，150 000 cpm/200 μL；其與低、中、高劑量組對應PEG-EPO濃度分別為39.075，26.050，13.025，2.605，1.302，0.260，0.130，0.039 ng·mL-1；127.505，85.004，42.502，8.500，4.250，0.850，0.425，0.128 ng·mL-1；427.527，285.018，142.509，28.502，14.251，2.850，1.425，0.428 ng·mL-1。各劑量組各濃度校正品取200 μL，用TCA法分離原型藥與代謝物，在γ計數儀上測定放射性cpm，以PEG-EPO濃度對其所對應的TCA沉淀物放射性計數cpm回歸，即可得到各組的校正曲線。結果顯示：PEG-EPO濃度與cpm呈直線相關，低、中、高各劑量組線性方程分別為y= 0.000 26x+ 0.001（r2= 0.999 9）、y= 0.000 9x-0.007（r2= 0.997 3）、y= 0.002 8x+ 0.008（r2= 0.999 9），定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）分別是0.039，39.075；0.128，127.505；0.428，427.527 ng·mL-1，各自覆蓋了該劑量組全部待測全血樣品的濃度范圍。

2.4 精密度測定

PEG-EPO工作液用大鼠空白全血配制理論放射性濃度為400，20 000，110 000 cpm/200 μL；400，20 000，95 000 cpm/200 μL；400，20 000，110 000 cpm/200 μL；在低、中、高劑量組中PEG-EPO濃度分別為0.104，5.210，28.655 ng·mL-1；0.340，17.001，80.754 ng·mL-1；1.140，57.004，313.520 ng·mL-1的質控樣品。用TCA法測定各劑量組質控樣品125I-PEGEPO的實際放射性計數值。日內每個質控樣品測定5次，連續測定5 d。低、中、高劑量組的日內和日間精密度RSD分別為1.78%～5.19%，5.73%～8.48%；1.53%～4.34%，4.32%～6.62%；3.72%～5.99%，5.45%～6.69%。

2.5 回收率測定

將PEG-EPO工作液用大鼠空白全血配制成低、中、高濃度梯度的質控樣品，各組濃度梯度分別為400，20 000，110 000 cpm/200 μL；400，20 000，95 000 cpm/200 μL；400，20 000，110 000 cpm/200 μL。PEGEPO濃度分別相當于0.104，5.210，28.655 ng·mL-1；0.340，17.001，80.754 ng·mL-1；1.140，57.004，313.520 ng·mL-1，用TCA法測定其125I-PEG-EPO的實際放射計數值。結果顯示：在各劑量組各自定量限范圍內，低、中、高劑量組的全血PEG-EPO測定平均回收率分別為95.75%～103.38%，97.88%～104.89%，99.30%～ 115.68%。

3 TCA法測定大鼠全血125I-PEG-EPO濃度

3.1 動物分組和給藥

18只大鼠分為3組，每組6只，雌雄各半。包括本次及其以下的所有試驗都要在給藥前12 h行大鼠腹腔注射1%KI溶液1 mL，用以封閉甲狀腺。設高、中、低（27，9，3 μg·kg-1）3個劑量組，給藥的放射強度分別為1.214，1.357，1.476 MBq·kg-1。給藥體積均為2 mL·kg-1。頸靜脈推注給藥，10 s內完成。分別于靜脈給藥后0，0.017（1 min），0.083（5 min），0.5，2，4，10，24，48，72，96，120 h 取全血約0.5 mL，抗凝，4 ℃貯存。

3.2 樣品血藥濃度測定

采用TCA法分離原型藥，并測定其放射性，分別用各劑量組的TCA法全血PEG-EPO校正曲線求得樣品的PEG-EPO濃度。放射強度衰變校正方法同“2.3”。

3.3 統計分析與結果判定

根據不同時間點的血藥濃度，繪出經時血藥濃度曲線圖。采用統計學分析軟件DASver1.0計算主要藥代動力學參數。采用SPSS13.0軟件進行組間方差分析，以判斷受試物體內過程是否呈現劑量依賴性。

4 結果

4.1 大鼠單次靜脈注射3種劑量PEG-EPO的藥代動力學研究

3個劑量組大鼠全血中血藥濃度-時間曲線比較見圖1。

圖1 不同劑量組（3，9，27 μg·kg-1）血藥濃度-時間曲線Fig 1 Plasma concentration-time curves of three dose groups (3, 9,27 μg·kg-1)

4.2 藥代動力學參數計算和統計學檢驗

實驗數據用DASver1.0軟件進行處理。遵循AIC最小原則，AUC、AUMC、MRT采用統計矩參數。低、中、高3個劑量組給藥后0.017 h（1 min）血藥濃度分別為（24.800±3.535），（80.971±16.368），（269.620±26.360） ng·mL-1，與劑量呈正相關，相關系數r= 0.999 8；動物血中藥物消除半衰期T1/2β分別為（27.22±3.67），（28.40±1.61），（33.12±1.83） h，隨劑量的增加無顯著變化；AUC0-120h分別為（69.22±7.13），（218.77±34.57），（470.42±65.88） ng·h·mL-1，與劑量呈正相關，r= 0.990 9，表明藥物在大鼠的體內過程呈線性動力學特征。統計結果見表2。

5 討論

目前已有多家機構開發出了多種方法延長EPO體內半衰期的方法，一種是增加rhEPO 分子量如EPO分子與人白蛋白連接或與人IgG1 Fc融合[5]，或通過多肽（3～17個氨基酸）連接成為同源二聚體；另一種方法是采用基因工程技術提高EPO分子糖基化程度，如Amgen公司生產的第二代重組人EPO（AranespTM），在EPO分子原有基礎上另外增加2條N-連接糖鏈，增加含糖量[6]。我們用聚乙二醇修飾rhEPO，增加分子量并降低蛋白酶的降解，可有效延長其體內代謝，屬于第一種方法。

表2 大鼠單次靜脈注射PEG-EPO藥代動力學參數.±sTab 2 Pharmacokinetic parameters of PEG-EPO after single intravenous injection in rats.±s

表2 大鼠單次靜脈注射PEG-EPO藥代動力學參數.±sTab 2 Pharmacokinetic parameters of PEG-EPO after single intravenous injection in rats.±s

藥代動力學參數 低劑量組 中劑量組 高劑量組A 8.134 2±1.170 6 32.723 8±6.479 6 59.442 9±8.210 4 α 0.372 8±0.110 4 0.414 3±0.115 4 0.314 4±0.062 2 B 1.079 4±0.400 2 2.871 0±0.755 0 5.299 1±1.043 6 β 0.025 9±0.003 6 0.024 5±0.001 4 0.021 0±0.001 1 T1/2α/h 2.00±0.56 1.80±0.57 2.28±0.44 T1/2β/h 27.22±3.67 28.40±1.61 33.12±1.83 Vd/L·kg-1 4.103 6±0.484 1 1.650 8±0.693 9 0.640 3±0.065 1 V1/L·kg-1 0.329 8±0.041 3 0.120 3±0.090 5 0.047 0±0.006 0 Cl/L·h-1·kg-1 0.047 1±0.005 8 0.020 2±0.011 1 0.006 9±0.001 0 K10/h-1 0.328 4±0.083 1 0.383 5±0.111 8 0.290 5±0.056 6 K12/h-1 0.041 0±0.029 7 0.028 8±0.008 5 0.022 2±0.005 7 K21/h-1 0.029 3±0.005 4 0.026 6±0.001 7 0.022 7±0.001 3 AUC0-120/ng·h·mL-1 69.22±7.13 218.77±34.57 470.42±65.88 AUC0-∞/ng·h·mL-1 71.72±7.65 226.35±34.52 496.57±68.51 AUMC0-1201 389.53±280.87 4 072.41±899.18 9 489.43±2 060.54 MRT0-120/h 19.93±2.06 18.54±2.06 20.01±1.56

rhEPO被PEG修飾后，rhEPO分子被PEG糖鏈包裹，一些分子表面的抗原表位被糖鏈遮蓋，將不利于用常規免疫分析法作為藥代動力學檢測方法，如使用rhEPO單克隆抗體的夾心ELISA檢測分析法；而色譜分析法對于大分子量的蛋白類藥物顯然也不太適合。因此，本文選擇經典的放射性標記分析方法，開展PEG-EPO的藥代動力學研究，了解PEG修飾達到的長效效果及動力學特征。

本文采用三氯醋酸沉淀法（TCA）和直接測定樣品放射性計數法（RA）進行示蹤研究。TCA能相對準確的分離原型藥物，基本反映原型藥的放射性，而RA可以反映原型藥、代謝物以及游離125I（125I－）放射性總量。本試驗所制備的放射性同位素示蹤劑125IPEG-EPO，其放射化學純度、比活度及其貯存穩定性均符合示蹤實驗的要求。EPO為含唾液酸的糖蛋白激素，分子中約40%為糖類，包括一個O-聯結和三個N-聯結的寡糖。EPO與PEG耦聯后進入機體也會發生降解，僅測定總放射性強度不能真實反映原型藥的情況。因此，需要在全血等樣品中分離原型藥。本試驗所用的三氯醋酸沉淀法對原型藥PEG-EPO與部分降解物和游離的125I－分離相對可靠。提高放射性比活度可以提高方法的靈敏度，但過高的放射性比活度會帶來不利影響，如標記物的生物活性受損等，在滿足靈敏度的前提條件下，選用較低的放射性比活度，以保證標記物的生物活性。方法學驗證結果顯示，本實驗在測試特異性、精確度、準確度、靈敏度、標準曲線測定范圍以及線性關系等均符合藥代動力學研究的技術要求。

本實驗分別設高、中、低（27，9，3 μg·kg-1）3個劑量組，分別相當于臨床擬用劑量的9，3，1倍，且3倍的劑量關系能較好顯示各劑量之間的差異。試驗所制備的放射性同位素示蹤劑125I-PEG-EPO，其放射化學純度、比活度及其貯存穩定性均符合示蹤實驗的要求。由于EPO為大分子蛋白類藥物，如- 20℃儲存引起的反復凍融可損壞蛋白質結構，故穩定性實驗只選用了室溫和4 ℃進行考察。

本實驗結果顯示，PEG-EPO在大鼠體內的消除半衰期是普通rhEPO的3～4倍，由此推測，PEG-EPO一次注射可以達到普通rhEPO三次或四次給藥的效果，這將明顯改善臨床上由于頻繁給藥給病人帶來的痛苦。我們還將開展大動物如獼猴等體內藥代動力學實驗再次驗證PEG-EPO的長效效果。

[1] Egrie JC, Dwyer E, Browne JK,et al.Darbepoetin alfa has a longer circulating half-life and greater in vivo potency than recombinant human erythropoietin[J].Exp Hematol, 2003, 31(4):290-299.

[2] 沈富兵，葛永紅，劉蘭軍，等.聚乙二醇化重組人紅細胞生成素在動物體內的作用[J].中國生物制品學雜志，2003，16（6）：336-338.

[3] 葛永紅，劉蘭軍，沈富兵，等.聚乙二醇對PEG化重組人促紅細胞生成素熱穩定性和生物學活性的影響[J].微生物學免疫學進展，2005，33（2）：24-28.

[4] Veronese FM.Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions[J].Biomaterials，2001，22(5): 405-417.

[5] 祝強，黃智華，黃予良，等.rhEPO-L-Fc融合蛋白的表達、生物活性和初步藥動學分析[J].生物工程學報，2008，24（11）：1874-1879.

[6] Macdougall IC.An overview of the efficacy and safety of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP)[J].Nephrol Dial Transplant, 2001, 16(Suppl 3): S14-S21.