20種抗菌藥物對(duì)肺炎鏈球菌的體外抗菌活性研究

宋秀杰，劉又寧，梁蓓蓓，白 楠，蔡 蕓，劉 浩，陳桂云，王 睿（.解放軍總醫(yī)院呼吸科，北京 00853；.解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室，北京 00853）

肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)是社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見的致病原之一，也是腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎、菌血癥的主要致病菌，近年來其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類等藥物耐藥日趨嚴(yán)重，且不同地區(qū)差異較大，逐漸引起臨床醫(yī)生的重視。肺炎鏈球菌是苛養(yǎng)菌，分離和培養(yǎng)都比較困難。門診治療社區(qū)獲得性呼吸道感染主要以經(jīng)驗(yàn)性治療為主，很少做致病原的培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，要想提高診斷和治療的成功率，不僅要結(jié)合病人的臨床特點(diǎn)和本地區(qū)致病原的流行病學(xué)情況，也要熟悉常見致病菌對(duì)常用藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，從而提高治愈率，防止抗菌藥物的濫用。為了解目前臨床常用的20種抗菌藥物對(duì)肺炎鏈球菌的抗菌活性，本文對(duì)臨床分離的60株肺炎鏈球菌進(jìn)行耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 抗菌藥物

青霉素、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、哌拉西林、復(fù)方新諾明、磷霉素、多西環(huán)素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、氧氟沙星、左氧氟沙星、加替沙星、紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、帕珠沙星（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）。莫西沙星由德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司饋贈(zèng)。

1.2 菌株來源

肺炎鏈球菌60株，來源于解放軍總醫(yī)院、北京醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬二院2004-2005年呼吸道感染痰和咽拭子標(biāo)本。經(jīng)VITEK微生物分析儀重新鑒定，15%甘油 + 腦心浸出液分裝后- 80 ℃ 冰箱保存，測(cè)定前復(fù)蘇傳代。質(zhì)控菌株采用肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.3 儀器

比濁儀（法國(guó)Bio-merieux），二氧化碳孵箱（美國(guó)NAPCO），96孔板（美國(guó)COSTER），VITEK微生物分析儀（法國(guó)Bio-merieux）。

1.4 培養(yǎng)基

哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限公司） + 5%脫纖維羊血。MH肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限公司） + 2%～5%裂解的馬血，用于培養(yǎng)基的馬血應(yīng)反復(fù)凍融，直到完全裂解。

1.5 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法[1]。（1）抗菌藥物的配制和稀釋：配制1280 μg·mL-1的受試藥物儲(chǔ)備液，以無菌磷酸鹽緩沖液倍比稀釋，每種藥物均配制成128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 3 μg·mL-1共13個(gè)濃度，分別取0.1 mL的不同濃度的受試藥物依次加入96孔平板；（2）菌懸液制備：自5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)的血平板上挑出單個(gè)菌落，加入2 mL MH肉湯中調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?，再用MH肉湯稀釋100倍；（3）接種：用微量加樣器取0.1 mL菌液依次由低濃度到高濃度加到孔中，置于35 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，20 h后記錄MIC結(jié)果。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和生長(zhǎng)對(duì)照孔。

1.6 MIC結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

判斷臨界值參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2007版M100-S17執(zhí)行，以無菌生長(zhǎng)孔的最高濃度為該藥對(duì)該細(xì)菌的MIC，全部試驗(yàn)均以質(zhì)控菌株的MIC判斷是否符合CLSI質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)并計(jì)算MIC范圍、MIC50、MIC90及敏感率，敏感率比較使用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 20種抗菌藥物對(duì)肺炎鏈球菌的敏感率及MIC

根據(jù)青霉素對(duì)60株肺炎鏈球菌的MIC結(jié)果，有青霉素敏感的肺炎鏈球菌（PSSP）42株（71.7%），青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PNSSP）18株(28.3%)；其中，青霉素耐藥的肺炎鏈球菌（PRSP）2株（3.3%），PNSSP（MIC≥0.12 mg·L-1）的發(fā)生率為28%，高耐藥株（MIC≥2 mg·L-1）為3%。青霉素對(duì)60株肺炎鏈球菌MIC范圍是0.015～2 μg·mL-1，MIC50和MIC90分別是0.06，0.5 μg·mL-1。除青霉素外其他19種抗菌藥物對(duì)肺炎鏈球菌的敏感率及MIC結(jié)果見表1。

2.2 20種抗菌藥物對(duì)60株肺炎鏈球菌的累積抑菌百分率

從累積抑菌百分率曲線來看，莫西沙星和阿莫西林/克拉維酸的抑菌能力最強(qiáng)，分別在0.5，2 μg·mL-1的濃度抑制了100%的菌落生長(zhǎng)。其余藥物的抑菌濃度均在4 μg·mL-1以上。具體見圖1～5。

圖1 阿奇霉素、紅霉素、克拉霉素和羅紅霉素對(duì)肺炎鏈球菌的累積抑菌百分率 (n = 60)Fig 1 The accumulative inhibition percentage of azithromycin,erythromycin, clarithromycin, roxithromycin against S.pneumoniae(n = 60)

圖2 多西環(huán)素、磷霉素、復(fù)方新諾明對(duì)肺炎鏈球菌的累積抑菌百分率 (n = 60)Fig 2 The accumulative inhibition percentage of doxycycline,fosfomycin, trimethoprim-sulfamethoxazole against S.pneumoniae(n = 60)

表1 60株肺炎鏈球菌對(duì)19種抗菌藥物的敏感率(%)及MIC值(μg·mL-1)Tab 1 Susceptibility of 19 antimicrobial agents against 60 strains S.pneumoniae and MIC

圖3 左氧氟沙星、氧氟沙星、帕珠沙星、加替沙星、莫西沙星對(duì)肺炎鏈球菌的累積抑菌百分率 (n = 60)Fig 3 The accumulative inhibition percentage of levofloxacin,ofloxacin, pazufloxacin, gatifloxacin, moxifloxacin against S.pneumoniae (n = 60)

圖4 阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、青霉素、哌拉西林對(duì)肺炎鏈球菌的累積抑菌百分率 (n = 60)Fig 4 The accumulative inhibition percentage of amoxicillin-clavulanic acid, oxacillin, penicillin, piperacillin against S.pneumoniae (n = 60)

圖5 頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢噻肟對(duì)肺炎鏈球菌的累積抑菌百分率 (n = 60)Fig 5 The accumulative inhibition percentage of cefuroxime,cefazolin, ceftriaxone and cefotaxime against S.pneumoniae (n = 60)

3 討論

肺炎鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥機(jī)制主要是青霉素結(jié)合蛋白（PBP）變異，導(dǎo)致抗菌藥物與靶位的親和力下降。肺炎鏈球菌有6種PBP，PRSP的發(fā)生主要與其中的3種相關(guān)：PBP1a, PBP2b和PBP2x。PBP基因的變異包括點(diǎn)突變和重組突變。多次重組事件的積累可導(dǎo)致菌株的耐藥。劉又寧等[2]對(duì)國(guó)內(nèi)7個(gè)城市665例社區(qū)獲得性肺炎患者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青霉素中介株占17.4%，PRSP占2.9%。肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制主要是靶位改變和外排泵，前者導(dǎo)致高水平耐藥，后者表現(xiàn)為低水平耐藥。法國(guó)、西班牙和中國(guó)的耐藥以靶位變異為主，美國(guó)和加拿大以主動(dòng)外排機(jī)制為主[3-4]。趙鐵梅等[5]研究了148株肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素的耐藥表型，其中內(nèi)在型耐藥（cMLS型）占85.1 %，誘導(dǎo)型耐藥（iMLS型）占4.1%，耐藥基因以ermB介導(dǎo)的靶位改變多見。Alexander監(jiān)測(cè)項(xiàng)目資料顯示：世界范圍內(nèi)肺炎鏈球菌對(duì)多西環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明的耐藥率分別為0.5%，11.9%，24.8%[6]。耐藥肺炎鏈球菌所致大葉性肺炎、流行性腦膜炎一旦治療不當(dāng)，將嚴(yán)重威脅人類的健康，密切關(guān)注其耐藥性的變化對(duì)臨床治療有重要意義。

本研究測(cè)定臨床分離的肺炎鏈球菌對(duì)常用20種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示：肺炎鏈球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物和第三、四代氟喹諾酮類藥物仍保持較高的敏感性，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物、復(fù)方新諾明、磷霉素、多西環(huán)素敏感性差，不適用于肺炎鏈球菌感染，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致。本研究比較了PNSSP組和PSSP組對(duì)常用藥物的敏感率，結(jié)果PNSSP組對(duì)頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、加替沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星的敏感率顯著低于PSSP組；喹諾酮類藥物除莫西沙星外兩組敏感率均有差異，說明PRSP在對(duì)青霉素敏感性下降的同時(shí)，對(duì)氟喹諾酮類藥物的敏感性也下降。同時(shí)，β-內(nèi)酰胺類藥物中除了阿莫西林/克拉維酸外，兩組敏感率均有差異，說明β-內(nèi)酰胺類藥物內(nèi)部存在交叉耐藥。本實(shí)驗(yàn)中PNSSP對(duì)臨床常用藥物敏感性最高的為阿莫西林/克拉維酸和莫西沙星，這兩種藥物抗菌譜廣、副作用小。對(duì)于懷疑肺炎鏈球菌感染的患者根據(jù)病情可優(yōu)先選用阿莫西林/克拉維酸或第三代頭孢菌素中的頭孢曲松或頭孢噻肟及第三、四代喹諾酮類藥物（如左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星），但氟喹諾酮類藥物不宜用于哺乳期婦女和兒童。

本文結(jié)果顯示：肺炎鏈球菌對(duì)氟喹諾酮藥物的耐藥率在0～11%之間，仍保持較高的敏感性。但近年來隨著肺炎鏈球菌對(duì)青霉素和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率上升，其對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥也出現(xiàn)上升趨勢(shì)。加拿大學(xué)者發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥率從1997年的1%上升到2005年的4.2%，同時(shí)對(duì)加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、莫西沙星的耐藥率也明顯上升，分別為1.6%，1%，10%，1%[8]。第三、四代氟喹諾酮類藥物在歐洲許多國(guó)家被推薦用于治療社區(qū)獲得性呼吸道感染，盡管處于較低的耐藥水平，但線性回歸分析顯示氟喹諾酮類藥物的使用與耐藥率呈正相關(guān)(r2= 0.76)[9]，提示臨床醫(yī)生要合理使用氟喹諾酮類藥物，防止耐藥的進(jìn)一步加重。

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