組織塊貼壁法培養大鼠主動脈平滑肌細胞及鑒定

王忠太，馬佳玲

（甘肅省康復中心醫院，甘肅 蘭州 730000）

組織塊貼壁法培養大鼠主動脈平滑肌細胞及鑒定

王忠太，馬佳玲

（甘肅省康復中心醫院，甘肅 蘭州 730000）

目的 建立大鼠胸主動脈平滑肌細胞的組織塊貼壁法。方法 采用組織塊貼壁法進行原代培養，胰酶消化法傳代，并應用相差顯微鏡和平滑肌肌動蛋白對細胞進行形態學和免疫組化鑒定。結果 90%的組織塊接種存活，培養5代的平滑肌細胞純度達98%以上。鏡下可見培養細胞呈典型的“峰-谷”狀生長，免疫組化染色顯示胞漿內平滑肌肌動蛋白陽性表達。結論 組織塊貼壁法培養大鼠平滑肌細胞操作簡單、結果穩定、純度較高、存活率高。

平滑肌細胞；組織塊貼壁法；原代培養

血管平滑肌細胞（VSMC）的異常增殖、遷移、凋亡不足及細胞外基質沉積造成的內膜增生是動脈粥樣硬化、冠狀動脈支架內再狹窄、移植血管病變的主要原因。動脈平滑肌細胞培養是進行平滑肌細胞分子生物學研究的基本條件，可用于多種與平滑肌細胞生長、增殖有關的疾病發病機理及藥物作用機制的研究，如動脈粥樣硬化、經皮腔內血管成形術（PTCA）術后再狹窄、藥物的鈣通道開放（拮抗）作用、血管損傷引起鈣穩態失衡等。本研究在參照國內外經驗[1～3]的基礎上，建立了一種簡便、易行的原代培養大鼠VSMC方法。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠體重120～150g，雌雄不限，購自蘭州大學GLP實驗動物中心。DMEM（高糖型）培養基、胰蛋白酶粉、標準胎牛血清均購自HyClone公司。小鼠抗大鼠SM-actin單克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司（中國）。青霉素鈉、硫酸鏈霉素（華北制藥廠），24孔板，10mm×10mm蓋玻片，25cm2塑料培養瓶（Costar公司）及手術器材。

1.2 細胞培養

1.2.1 原代培養 SD大鼠斷頸處死，放血，75%乙醇浸泡5min，移入超凈工作臺內，沿腹中線剖開胸腔、腹腔，剪開膈肌，翻開左側肺葉，可見在脊柱前走行的胸主動脈。小心分離取出胸主動脈，立即置于含青霉素100U/ml，濃度100mg/ml硫酸鏈霉素的無菌PBS液體中。用兩把眼科鑷輕輕夾住血管向相反方向稍用力牽拉，呈袖套樣剝除外膜。更換平皿，用PBS液漂洗2次后，縱向剖開血管，將血管內膜面朝上平鋪于培養皿上，用眼科彎鑷鈍性刮除內膜，以去除內皮細胞。用眼科彎剪反復將其剪成1mm×1mm的組織塊，邊緣整齊、光滑，用彎頭吸管移入并均勻貼放于25cm2培養瓶底面，間隔約5mm，輕輕翻轉培養瓶，讓瓶底朝上并向瓶內加入約4ml含體積分數20%胎牛血清的培養基。然后瓶蓋旋松，于CO2培養箱中靜置4～6h，使組織塊干涸并與瓶底貼壁附著后，將培養瓶慢慢翻轉平放，使組織塊完全浸入培養液中，繼續靜置于37℃的CO2孵箱中3～7d。待有細胞從組織塊周圍游出后換液，以后約2～3d換液1次。

1.2.2 細胞換液 細胞換液主要根據細胞生長狀況及培養液的顏色變化決定。當細胞增殖旺盛，培養液由桃紅色變為黃色時，需換液。在超凈工作臺上，吸棄原培養基，用PBS液輕輕沖洗后，加入新鮮的含體積分數20%胎牛血清的培養基繼續培養，也可進行半量或2/3量換液。換液時應動作輕柔，盡量不要碰到組織塊。

1.2.3 細胞傳代 至單層細胞鋪滿近培養瓶底的80%以上時即可進行傳代。將原代細胞瓶內的培養液小心吸棄，加入PBS液2ml輕晃培養瓶沖洗細胞，吸棄，加0.25%（g/L）胰酶液2ml在37℃消化約40s。倒置顯微鏡下見細胞回縮、變圓，細胞成片收縮呈球形時，立即加入含血清培養基終止消化。然后輕輕吹打瓶壁細胞使其完全脫落，形成的細胞懸液按1∶2或1∶3接種。周期約為5～7d。首次傳代時，脫落的組織塊可以轉移到新的25cm2培養瓶中，按原代培養方法使組織塊重新貼壁。24h后可見細胞重新貼壁生長。以后約2～3d換液1次，1周左右后細胞再次長成致密單層時即可再次傳代。待細胞傳代至3～5代，即可用于實驗。

1.2.4 細胞凍存、復蘇 凍存時取對數生長期細胞，凍存前一天最好換液。消化細胞將其收集于離心管，計數、離心后棄上清液，加凍存液（DMSO、血清、DMEM 培養基以 1∶3∶6 配制），使細胞的最終密度為（5～10）×106/ml，分裝入凍存管中，置4℃冰箱冷卻1h后轉入-20℃冰箱冷卻2h，最后保存在-70℃冰箱中。復蘇時從-70℃冰箱中取出凍存管，直接投入37℃水浴箱中，使其盡快融化。用吸管吸出細胞懸液，注入離心管加含20%胎牛血清的培養液，離心后棄上清液。培養液適當稀釋后接種于培養瓶，放入CO2培養箱靜置，次日更換培養液，繼續培養。

2 結果

2．1 平滑肌細胞培養及形態學觀察

原代培養第4～7d，可見少量細胞自組織塊邊緣游出，但不是所有的組織塊周邊都有，漸向外生長形成細胞暈，進而形成細胞簇，且形態多樣（梭形、多角形、星形或不規則形），大小略有差異。此后細胞呈放射性生長，至第10d，隨著細胞的增殖，培養瓶內可見大量細胞平行生長鋪滿瓶底。部分區域細胞多層重疊，部分區域高低起伏呈“峰-谷”狀生長。傳代后80%～90%的細胞可重新貼壁生長，其生長方式及形態特點同前。

2.2 VSMC組織學鑒定

培養第5代的細胞經特異的SMα-actin免疫細胞化學染色后，胞漿著棕黃色，呈陽性表達。此免疫組化結果表明，所得細胞確為典型的VSMC。

3 討論

VSMC的增殖是介入術后再狹窄發生和動脈硬化（AS）過程中的一個關鍵因素。在動脈粥樣硬化病變的發展和血管損傷的反應中，VSMC遷移至血管壁內膜下，離開靜止期G0/G1，進入細胞周期促進病變的反應[4]。因此，研究防治VSMC增殖成為血管生物學領域的熱點。體外VSMC為尋找新的防治方法提供了實驗模型。

研究表明，平滑肌細胞是動脈中膜唯一類型的細胞，因此主動脈中膜可作為獲取平滑肌細胞的最佳來源。目前，常用的方法有酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法雖然培養周期短、產量高，但膠原酶價格昂貴，且試驗中污染機會大，最佳消化時間不好把握，消化酶本身對細胞有毒性作用，易消化過度導致細胞活力不佳。組織塊貼壁法具有獲得平滑肌細胞純度高、量多，操作簡單的優點，可避免酶消化法的上述弊端。

在培養過程中，應注意以下幾點：（1）選擇血管供體時，一般選用120～150g的大鼠。體重太小，血管細，操作困難；體重太大則細胞活力弱，不易生長。（2）取下胸主動脈至將組織塊種植到培養瓶時間最好不要超過半小時；嚴格無菌操作，減少污染機會。（3）剝除血管外膜和內膜時，動作輕柔，避免用力牽扯，使細胞受傷，活力下降。（4）分離中膜時，要徹底剝離內膜與外膜，以減少內皮細胞和成纖維細胞的污染。（5）組織塊大小以1mm3較為合適，邊緣整齊、光滑，以利于細胞游出。注意細胞密度，一般取2～3只大鼠的胸主動脈組織塊均勻接種于25ml培養瓶中，間隙約2～3mm，以保證細胞游出后有足夠的生長空間并保持細胞密度的均勻。（6）組織塊干涸貼壁后及時翻正培養瓶，時間約為1.5～3h。干涸時間短有利于細胞存活，但不利于貼壁。（7）及時清理漂起的組織塊。可將漂起的組織塊轉移到新的培養瓶中重新貼壁，繼續培養。（8）營養液中血清質量是關系到培養能否成功的重要因素，最好使用優質的胎牛血清，原代培養時可將血清濃度提高到25%，消化傳代后營養液中血清濃度為15%。（9）一般3～5d換液1次，換液時不可將瓶內原培養液全部換掉，應保留1/3原培養液，然后加入新鮮培養液至原量。這樣可使細胞保持相對穩定的體液環境，又不致缺乏營養，有利于細胞保持正常的生長速度。

[1]Wang Z，Rao P J，Castresana M R，et al.A method to isolate morphologically distinct clones of smooth muscle cells from human saphenous vein[J].Methods in Cell Science，2002，24:131～137.

[2]Lemire J M，Covin C W，White S，et al.Characterization of cloned aortic smooth muscle cells from young rats[J].Am J Pathol，1994，144:1068～1081.

[3]梁若斯，陳德.成人動脈平滑肌細胞體外培養模型的建立[J].中國現代醫學雜志，2002，12（10）:31.

[4]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Narue，1993，362:801～809.

G424.31

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1671-1246（2010）03-0097-02