內源性干細胞修復腦損傷的研究進展

郭芮兵綜述,徐格林審校

目前越來越多的證據表明中樞神經系統具有潛在的自我修復能力,成體腦內海馬(包括人類)齒狀回的亞顆粒層(subgranular zone,SGZ)和位于前腦側腦室的室周帶(subventricular zone, SVZ)可終生持續產生神經干細胞。這些內源性干細胞能夠自我更新,具有分化為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞的潛能,它們為成體腦內的特定部位(海馬和嗅球)不斷提供新生細胞。研究者們已利用多種腦損傷的動物模型(包括缺血缺氧、癲癇、腦外傷等)揭示了損傷后內源性干細胞增殖、遷移和分化的變化規律,并探討了可能的影響機制,本文就近年來的研究進展做一綜述。

1 腦損傷后內源性神經干細胞的增殖及其影響因素

1.1 腦損傷刺激內源性神經干細胞增殖 大量研究表明腦損傷能夠使內源性干細胞的數量增加,包括大鼠雙側或單側前腦短暫腦缺血、大鼠皮質局灶缺血[1]、猴的半球缺血[2]等,均能觀察到缺血損傷后腦內增殖區新生細胞的數量明顯提高,特別在缺血后兩周內,但其后新生細胞的數量逐漸回復正常。此外,腦外傷后內源性干細胞的增殖也出現明顯增加[3],機械損傷海馬齒狀回顆粒層可刺激神經前體細胞增殖[4],增殖的細胞大部分標有成熟神經元標記物鈣結合蛋白。癲癇發作可誘導前腦室管膜下區內的神經元增加,在某些細胞因子的作用下遷移至異常放電灶,替代異常神經元,癲癇持續狀態發作可增加齒狀回的神經發生,然而,有研究者在額葉癲癇中發現,新生的神經干細胞也可能致癇[5]。在神經變性疾病帕金森病(Parkinson disease,PD)的早期,局部多巴胺能神經元丟失后,室管膜下區的神經干細胞被激活,在因子的引導下靶向性遷移至丟失區,使神經系統得到一定的修復。在阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者中,局部神經元纖維纏結釋放出信號,激活神經干細胞發生增殖與遷移,但大部分比較嚴重的退行性疾病仍不能被修復。

1.2 影響增殖的幾種相關因素 近期研究提示有多種因子刺激神經增殖,其中一些對腦損傷后內源性干細胞的增殖起作用,包括神經生長因子(nerve grow th factor,NGF)內皮細胞生長因子(endothelium growth factor,EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、干細胞因子(stem cell factor,SCF)、促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)、誘導性一氧化氮合酶(the inducible form of nitric oxide synthase,iNOS)、Wnt蛋白和凋亡前因子Bax等等,以下將分別敘述。

NGF對神經系統具有重要的神經營養和促進神經突起生長的生物效應。腦損傷后,NGF可促進內源性神經干細胞增殖,保護受損神經元,促進神經纖維再生,誘導軸突發育,從而使受損的神經系統修復。研究發現,在腦室內連續注射NGF,可明顯改善重型顱腦損傷嬰兒的腦功能,減少腦軟化灶,改善腦組織局部灌注[6];有研究者[7]向大鼠腦室內注入NGF抗體,結果可使皮質神經元細胞死亡增加,皮質變薄,情感和認知功能明顯受損,這說明NGF在維持神經元存活及其功能中起著至關重要的作用。

EGF是一種能夠促進神經干細胞增殖的生長因子,另一個名為肝素接合的 EGF樣生長因子(HB-EGF)也通過EGF/ErbB1受體和EGF敏感受體起作用。有研究證實[8],缺氧后4 ～8小時鼠胚胎皮質培養物中HB-EGF的含量即明顯增高,外源性HB-EGF能夠促進BrdU合成到常氧環境培養物中。HB-EGF作用于側腦室也能促進BrdU合成到SVZ和SGZ腦區,且大多數BrdU+(5-溴脫氧尿苷)細胞是神經元前體細胞。在新生大鼠,HB-EGF在單側頸動脈結扎后16 ～24小時于損傷半球的表達明顯增加,表達最強的部位則是梗死灶周邊的神經元。這些研究結果提示,EGF促進缺血損傷后神經前體細胞的增殖。

bFGF是神經干細胞的生長因子,一項利用bFGF基因敲除鼠進行的研究bFGF在缺血損傷后神經前體細胞的增殖中有重要的作用[9]。缺血損傷時 bFGF裸鼠海馬區的 BrdU+細胞數正常,但MCAO(大腦中動脈阻斷法)后BrdU+細胞數較未行bFGF基因敲除的正常鼠明顯減少達55%。這說明bFGF確實在缺血損傷刺激神經前體細胞的增殖中起作用。近期一項研究表明,腦外傷后腦室內注射bFGF能有效促進內源性干細胞的增殖,并讓這些新生的干細胞存活至損傷后4周[10]。

SCF也在缺血損傷刺激神經前體細胞的增殖中起作用[11]。缺氧后鼠胚胎皮質培養物中bFGF和SCF的濃度均有增加,都能夠促進BrdU合成到常氧環境培養物中。兩者的效應不能疊加,提示二者的作用機制相似。在體試驗證實SCF的受體—c-kit受體酪氨酸激酶存在于腦內增殖區,缺血可以誘導SVZ和SGZ區表達c-kit的細胞數量增加。同時,SCF能夠提高BrdU+細胞數量,這些細胞大多為不成熟的神經元細胞。

EPO是調節缺血損傷后神經前體細胞增殖反應的另一個較強的因子。免疫組化研究顯示成體動物SVZ區既有EGF受體,又有EPO受體[12]。體外細胞培養實驗中,單個神經前體細胞能夠增殖成為粘在一起的細胞克隆,這些神經前體細胞能夠自我更新,當初級細胞團被分離后,它可以增殖為次級細胞團。如果移去培養介質中的促有絲分裂源,神經前體細胞可以分化成為神經元或膠質細胞。用含有EPO的常氧環境培養物或低氧環境培養物能夠使神經元的產出率較前高2 ～3倍。缺氧4小時,神經前體細胞培養物中EPOmRNA的表達就會明顯提高。在體研究顯示,EPO作用于未損傷動物的側腦室會戲劇性的減少SVZ區神經前體細胞的數量,同時提高背外側 SVZ區和 RMS區(rostal migratory stream)Mash1(bHLH家族成員之一,參與神經元分化等)陽性前體細胞的數量。這些研究證明缺氧時神經前體細胞EPO表達上調,EPO可以促進神經前體細胞分化為神經元,提示EPO可以增強卒中后的神經增殖。

還有一個被證實與缺血損傷后神經增殖有關的因子是iNOS[13]。成年大鼠MCAO損傷后同側DG區iNOS高水平表達。抑制iNOS的活性卻不影響其表達能夠減少缺血后BrdU合成到干細胞中的水平。用iNOS基因敲除鼠可以得到相同試驗結果,然而這些動物的梗死面積也明顯減小。這個結果使得判斷細胞增殖的下降到底是缺乏iNOS所致還是損傷減輕所致比較困難。但不管如何,這提示缺血損傷后還有另一種機制影響著神經增殖。

Wnt蛋白[14]能夠維持缺血后SVZ區內源性干細胞的存活并刺激其增殖。凋亡前因子Bax[15]是影響干細胞存活的一個關鍵因素,如果小鼠缺乏Bax則腦外傷后干細胞增殖明顯增加,并且它很有可能是通過鉀通道的Kv4家族起作用。

2 腦損傷后內源性干細胞的遷移及其機制

2.1 腦損傷促進內源性干細胞向損傷區遷移 腦損傷后增殖只有在新生細胞能夠到達細胞缺失的腦區才是有意義的。對此,已有研究通過觀察到新生細胞能夠遷移出增殖區而間接證實。對MCAO損傷同側半球BrdU+/DCX+(DCX,一種神經元前體細胞的早期標志物)細胞的研究發現,這些前體細胞具有遷移細胞的形態,能夠從SVZ區遷移到紋狀體區,而在損傷對側未見此遷移,但這種現象提示新生細胞正向損傷區遷移。另有研究觀察了 PSANCAM(一種遷移細胞表達的粘附分子)在成年大鼠MCAO后的表達變化,并發現損傷后3天該分子在SVZ區的表達增加[16]。雖然此結論提示新生細胞正從其生發區遷移出來,但由于缺血損傷還可以刺激星形膠質細胞表達PSA-NCAM,因此無法區分這些PSA-NCAM+細胞到底是神經前體細胞還是星形膠質細胞。為此,有研究[17]將脂性熒光染料DiI于成體大鼠缺血損傷后2天注入側腦室,注射后2天可見DiI+細胞局限于后室周帶區,而在缺血后4周,許多DiI+細胞出現在了損傷海馬的CA1 區,更重要的是,88%的NeuN+細胞也是DiI+細胞;在無缺血發生的動物中注射DiI后4周DiI+細胞仍局限于后室周帶區。這說明缺血后新生細胞確實遷移到了損傷區。

2.2 影響遷移的幾種相關因素 生長因子中的NGF可以促進內源性神經干細胞的遷移,它僅出現在遷移期的神經前體細胞,其受體erb表達于遷移期的放射狀膠質細胞,阻斷受體erb后,神經前體細胞的遷移受到抑制,完成遷移后的放射狀膠質細胞分化為星形膠質細胞。VEGF也促進內源性神經干細胞的遷移[18],它能夠促進支架蛋白(IQGAP1)的表達[19],IQGAP1本身存在于神經前提細胞和NSCs(神經干細胞)的胞漿內,但可以和膜整合蛋白相互作用從而參與神經前體細胞的遷移。炎癥因子可以作為炎性刺激物使體內原有的神經細胞產生趨化因子參與干細胞的遷移。Belmadani等[20]發現:小鼠的單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)敲除后,神經前體細胞向損傷處的遷移顯著減少,表明神經損傷后,炎性細胞促進趨化蛋白(趨化因子)的表達,引導干細胞的遷移。腦外傷后,局部神經組織發生變性,誘發炎癥反應,通過一些炎癥因子及趨化因子的表達,激活神經干細胞的遷移。許多炎癥因子還可以作為炎性刺激物使體內原有的神經細胞產生趨化因子參與干細胞的遷移,一些炎性刺激物如:IFN-γ、gp120(一種包膜糖蛋白)可激活小膠質細胞和星形膠質細胞合成大量趨化因子、細胞因子,參與神經前體細胞的遷移[21]。

Slit蛋白可以通過排斥作用指導SVZ區神經前體細胞的遷移;reelin蛋白可促進神經干細胞在接受新的信息后向特定部位遷移并分化為有功能的成熟細胞。腦缺血后,新生細胞PSA-NCAM表達增加與新生細胞的遷移有關,如果用PSA-NCAM受體的阻斷劑或者剔除PSA-NCAM的基因均會阻礙新生細胞的遷移。而腦外傷后神經干細胞的遷移可能與外傷刺激干細胞受體C-kit的激活有關。

3 腦損傷后神經前體細胞存活并分化為成熟細胞

一些研究探討了缺血后新生細胞是否能夠長期存活并分化為成熟細胞。有研究在成年大鼠MCAO后第1周內注射BrdU,然后分析這些BrdU+細胞損傷后4周時的變化[22]。該研究發現,損傷側紋狀體BrdU+/NeuN+細胞數量較對側或正常對照組增加31倍,而細胞密度之間的差異甚至比絕對細胞數之間的差異更大,這是因為缺血損傷將部分受損的紋狀體分割成了小塊。BrdU+/NeuN+細胞的密度在第4周時比在第2 周時高了9.7倍,提示前體細胞在這4 周的損傷恢復期中不斷的成熟。BrdU+/DCX+細胞同時表現為Meis2和Pbx(兩種發育中紋狀體細胞的標志物)染色陽性,也提示神經前體細胞正在損傷的紋狀體中成熟。此外,在損傷后第5周,42%BrdU+/NeuN+細胞還表達DARPP-32(一種紋狀體成熟中間神經元的標志物)。這些都說明紋狀體中有部分新生細胞發育成為具備該區域細胞相應特征的成熟細胞。對于海馬的研究也發現了類似的結果。

上述研究證明了缺血后部分新生細胞能夠發育成為成熟的神經元,但這還是不夠的,還需要對這些細胞進行更長時間的觀察,因為這些細胞要和腦內局域其他細胞形成功能聯系還需要更長的時間。雖然目前的研究集中于神經元的新生,有研究提示其他類型的細胞也在損傷修復中起作用。對星形膠質細胞在缺血損傷后的反應已有較多了解,而對少突膠質細胞卻知之甚少。有研究表明缺血損傷后2周內可見梗死灶周邊少突膠質細胞前體細胞數量明顯增多,但這些細胞的作用卻仍不明確。

影響分化的幾種相關因素:腦損傷后內源性神經干細胞的分化與環境密切相關,它們可以在神經營養因子的控制下分化成一定種類的神經細胞。許多神經營養因子可以通過與神經干細胞上特異受體的結合激活細胞內信號促使細胞分化。腦梗死后可誘導產生神經營養因子,如腦源性神經營養因子(BDNF)、bFGF、NGF等。每種神經營養因子均有不同時間和區域分布的特點。睫狀神經細胞營養因子(CNTF)的含量在一過性MCAO 120分鐘后2天明顯增高,且在額葉、頂葉和枕葉處含量增加。CNTF可促使神經干細胞分化為星形膠質細胞和小膠質細胞,與梗死后病灶區星形細胞增加有關。有學者證實,在大鼠MCAO后,海馬bFGF增加,并促使神經干細胞分化為神經元。bFGF在神經干細胞增殖的早期階段發揮促有絲分裂的作用,使神經干組胞獲得對另一作用更強的促有絲分裂因子表皮生長因子的反應性;而表皮生長因子在神經干細胞增殖后期發揮作用[23],轉化生長因子β 1(TGFβ1)可促進干細胞的分化并遠離細胞分裂池向損傷處遷移[24]。

4 增強神經前體細胞對腦損傷的反應可以促進功能恢復

腦損傷后外源性因子對神經前體細胞增殖和成熟的促進作用提示這些因子可以用來治療腦損傷。研究表明[17],在缺血損傷的第2 ～5 天將bFGF和EGF(兩種神經前體細胞的促有絲分裂原)注入側腦室能夠促進神經前體細胞的增殖,并且,這些增殖的神經前體細胞有一半以上表達NeuN,能夠存活6個月。還有研究證實生長因子可以促進缺血后新生的細胞整合進入海馬區局部神經環路。在缺血后經過較長時間的恢復,用 MAP2(微管相關蛋白Ⅱ)和synapsin 1(突觸蛋白-Ⅰ)對海馬的CA1 區進行染色,發現生長因子處理后樹突和突觸的數量明顯增多,其突觸形成乃通過電子顯微鏡觀察而證實。通過將逆行示蹤劑注射到海馬回下腳標記CA1區的BrdU+細胞,證實新生神經元在生長因子作用下整合進了適當部位。

腦損傷后的功能恢復是治療之最終目的。Nakatomi等[17]利用電生理學技術對海馬薄片培養物檢測后發現,缺血損傷后局部的突觸后電位較假手術對照組明顯減弱。損傷后經生長因子干預的缺血動物其局部場電位較對照組相有所增高。神經功能評估也證實生長因子干預的缺血動物明顯恢復。缺血可以使動物的認知功能明顯下降,這可以通過莫里斯水迷宮試驗(一種檢測動物認知功能的試驗)來證實。通過動物試驗發現,動物訓練1周時,缺血損傷后的動物(不論是否給予生長因子)較正常動物有明顯的缺陷;而動物訓練7周時,缺血損傷后給予生長因子的動物表現與正常動物相同,而缺血損傷后未給予生長因子的動物仍表現出明顯的認知功能障礙,這可能與生長因子促進神經增殖有關。

5 展 望

綜上所述,神經干細胞對機體的自我修復起著重要的作用,腦損傷能夠刺激內源性干細胞的增殖并能促進增殖的干細胞向損傷區遷移,雖然這種增殖和遷移僅發生在損傷早期。此外,他們還能分化為成熟的神經元細胞[25]。這些研究為腦損傷患者帶來了曙光,但問題在于,這些新生細胞的存活率僅為20%,其中又只有0.2%能夠替代缺血后死亡的細胞[21]。因此,目前的主要任務是弄清楚內源性干細胞對各種損傷反應的細胞及分子機制。包括分析反應期參與的特殊分子和影響內源性神經干細胞最終分化的局部因素。一旦弄清楚這些機制,就能提供明確的治療措施,這將為腦損傷的遠期恢復提供更好的治療,很可能會戲劇性的改善因腦損傷而致殘的患者的生活質量。總之,內源性干細胞為治療各種腦損傷提供了廣闊的前景。

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