水通道蛋白4在大鼠外傷性腦損傷的表達(dá)及意義

廖馭國

（河源市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 河源 517000）

外傷性腦損傷在臨床上相當(dāng)常見，是危害人類生命的幾種主要疾病之一，隨著社會(huì)城市化建設(shè)，車禍、墜樓等意外傷害導(dǎo)致腦損傷的增加。腦水腫是大腦損傷后的主要并發(fā)癥之一，而且影響腦功能的恢復(fù)。本研究旨在通過大鼠外傷性腦損傷的研究，探討外傷性腦損傷后AQP4蛋白及其mRNA的表達(dá)變化規(guī)律，并對(duì)外傷后腦組織中AQP4的表達(dá)與腦水腫的相關(guān)性進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討外傷性腦水腫的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（300±20）g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供用隨機(jī)數(shù)字表法分為腦外傷組（包括腦外傷后4、8、12、24h和5 d）、假手術(shù)對(duì)照組。

1.2 方法

動(dòng)物模型制作 采用改進(jìn)的Feeney氏法[1]體腦損傷裝置進(jìn)行致傷打擊，致傷沖擊力約為20×50 g/cm 制作外傷性顱腦損傷模型 。實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.35%戊巴比妥鈉 (按30 mg/kg)行大鼠腹腔注射麻醉，俯臥位固定頭部，去除大鼠頭頂部皮膚的毛發(fā)。常規(guī)消毒鋪巾，矢狀切開頭皮，于矢狀縫旁2.5 mm，冠狀縫后1.5 mm鉆一骨孔，直徑5.0 mm，顯露硬腦膜，在硬腦膜上放置墊片，打擊器下端直徑2.0 mm，下陷深度控制為2.0 mm，運(yùn)用砝碼自由落體打擊器打擊硬膜上墊片造成腦組織挫裂傷。假顱腦外傷模型組僅行頭皮切開，分離骨膜，暴露頂骨，鉆骨孔顯露硬腦膜，用頭釘帽及骨蠟封閉骨窗，再縫合切口等處理。

腦組織標(biāo)本的采取 腦外傷組按照分組時(shí)間點(diǎn)、假手術(shù)組動(dòng)物于術(shù)后8 d分別用異戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，迅速脫頸斷頭，剝離局部軟組織，分離去除顱骨和腦膜，以骨窗為中心，切取腦組織。將腦組織標(biāo)本從中心點(diǎn)一分為二，取腦傷灶前緣約2 mm處腦皮層1塊，約(5×5×5)mm大小，立即經(jīng)體積分?jǐn)?shù)4%中性甲醛固定24 h，蒸餾水清洗12 h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片厚約4μm，經(jīng)脫蠟后，采用免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡鏡下觀察。

腦損傷不同時(shí)段AQP4的表達(dá) 大鼠腦外傷后，損傷側(cè)腦組織水含量較假手術(shù)組增加，6 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，24 h達(dá)高峰。與假手術(shù)組比較損傷側(cè)腦組織IgG漏出在外傷后1 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，6 h達(dá)高峰。免疫組化染色顯示損傷周圍處星形膠質(zhì)細(xì)胞上AQP4的分布極性發(fā)生變化，毛細(xì)血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上AQP4表達(dá)增加，同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體亦出現(xiàn)AQP4表達(dá)。AQP4表達(dá)變化的時(shí)間與腦組織水含量變化一致，晚于IgG漏出的變化。

2 結(jié)果

腦創(chuàng)傷后AQP4表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠外傷性腦損傷后AQP4表達(dá)逐步上調(diào)，AQP4及其mRNA表達(dá)即開始增加并持續(xù)上升，4 h后開始表達(dá)上調(diào)，8 h、12 h依次增高，24 h達(dá)到峰值(P＜0.05)，3 d時(shí)仍維持較高水平，傷后5 d有所降低。腦含水量與AQP4 mRNA表達(dá)變化一致，這與Sun[2]等在大鼠局灶性皮層挫傷模型中觀測(cè)到的結(jié)果一致。腦損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)。Sun發(fā)現(xiàn)自由落體致大鼠腦損傷24 h后損傷區(qū)腦水腫明顯上調(diào)，在周邊臨近區(qū)下調(diào)，在遠(yuǎn)處區(qū)無明顯變化。24 h后損傷部位腦水腫程度和AQP4 mR-NA表達(dá)均顯著增加，鄰近損傷位點(diǎn)出現(xiàn)相反改變，遠(yuǎn)離損傷點(diǎn)AQP4表達(dá)卻無變化。

3 討論

水通道蛋白- 4(AQP4)在腦組織中分布廣泛[3]QP4可調(diào)節(jié)腦組織及腦脊液中水液代謝。近年來研究發(fā)現(xiàn)在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有AQP4表達(dá)的變化。AQP4在成年老鼠大腦內(nèi)主要分布[4]有膠質(zhì)細(xì)胞、腦室室管膜上皮細(xì)胞，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、其次為腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞，其中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其相連的膠質(zhì)細(xì)胞，其與血腦屏障密切相關(guān)。其解剖分布提示AQP4在腦內(nèi)主要參與腦內(nèi)水代謝的調(diào)節(jié)。相關(guān)細(xì)胞的主要生理功能是參與腦脊液的形成和重吸收，提示AQP4參與調(diào)節(jié)腦脊液的形成和重吸收。

本實(shí)驗(yàn)推論大鼠外傷性腦損傷導(dǎo)致腦水腫的病理機(jī)制之一[5]損傷誘發(fā)了血腦屏障的膠質(zhì)細(xì)胞胞膜上AQP4的表達(dá)，促進(jìn)了體液能夠迅速通過毛細(xì)血管滲入神經(jīng)組織間隙所造成的。故認(rèn)為，發(fā)生腦組織水腫時(shí)AQP4表達(dá)增加是膠質(zhì)細(xì)胞適應(yīng)細(xì)胞外環(huán)境變化的反應(yīng)，同時(shí)AQP4的過度表達(dá)促進(jìn)了相關(guān)細(xì)胞水腫的發(fā)生和發(fā)展，而AQP4表達(dá)的下調(diào)或缺無對(duì)減輕腦水腫程度、降低死亡率有重要作用。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)對(duì)人類高發(fā)病率、高死亡率、高致殘的急性外傷性腦水腫的治療有重大意義，AQP4抑制劑或負(fù)調(diào)節(jié)物將在外傷性腦損傷治療中起重要作用，將更好地幫助我們改進(jìn)目前的治療方案、發(fā)展新的治療策略。

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