膜聯蛋白在動脈粥樣硬化中的研究進展

鄔 強 綜述，錢士勻 審校

（海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院，海南 海口 571101）

膜聯蛋白亦稱為鈣磷脂結合蛋白，是一類依賴Ca2+的膜磷脂結合蛋白超家族，廣泛分布于各種真核細胞膜、細胞質和細胞外，約占細胞總蛋白質的2%左右[1]。其家族各成員結構上具有極高的同源相似性，C端均由約70個氨基酸殘基組成的4個(Annexin A6為8個)保守重復序列，構成獨特的Ca2+-膜結合中心結構域，使之可逆性錨定于細胞膜上。家族中不同的膜聯蛋白成員N端序列長度不同，各具獨特的基因表達方式和組織特異性，表明特異的N端區域與各種膜聯蛋白的特異功能有關[2]。膜聯蛋白更易于與酸性磷脂結合，尤其是磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酸，不同的膜聯蛋白在機體的不同組織和部位執行著不同的生物學功能。

1 膜聯蛋白家族組成、結構及生物學功能

自1977年膜聯蛋白首次發現以來，其家族成員不斷增加，現有超過1000種不同的基因表達產物組成，廣泛存在于不同門、種的大多數真核生物細胞（動物、植物、真菌）中，物種間高度保守[3]。目前膜聯蛋白超家族可以分為A、B、C、D、E 5個家族，A族主要存在于脊椎動物細胞，已確定有12個成員(Annexin A1-A11，Annexin A13)。人膜聯蛋白基因大小從15 kb(Annexin A9)到96 kb(Annexin A10)不等，定位于1、2、4、5、8、9、10及15號染色體上。大多數家族成員分布于細胞內、細胞膜，而Annexin A1、Annexin A2及Annexin A5等也在細胞外有發現，如存在于血液中[4]。由于缺乏信號肽結構，膜聯蛋白如何轉運出細胞的機制尚不清。

膜聯蛋白結構上包括C端中心結構域和N端結構域。X射線晶體衍射實驗發現其中心結構域大多由5個α螺旋形成的圓盤狀結構組成，凸面包含膜磷脂結合位點及2個典型的Ca2+結合位點，面向細胞膜。不同膜聯蛋白的中心結構域大約有50%的氨基酸序列同源。N端位于圓盤結構的凹面，游離延伸與中心結構域相互作用，調節其穩定性。影響Ca2+依賴的圓盤凸面與帶負電荷的膜磷脂結合，另外還包括蛋白水解位點、磷酸化位點及細胞質蛋白結合位點，為膜聯蛋白的調節區。在未結合Ca2+時，N端藏于中心結構域內，結合Ca2+后，N端暴露于分子外[5]。

近年來，國內外通過基因抑制(Gene Knockdown)、基因敲除(Gene Knockdown)、RNA干擾(RNA Interference)及顯負性突變體(Dominant negative mutant)等方法研究發現膜聯蛋白具有多種生物學功能，在細胞中參與膜轉運及膜表面一系列依賴于鈣調節蛋白的活動，包括囊泡運輸、胞吐作用中的膜融合、信號轉導和鈣離子通道的形成、調控炎性反應，參與凝血過程，參與細胞凋亡、細胞分化和細胞骨架蛋白間的相互作用等[6]。膜聯蛋白與人類許多疾病的發生發展相關，尤其在心血管疾病、腫瘤、炎癥、糖尿病及自身免疫病中的作用機制成為當前的研究熱點。某些膜聯蛋白的表達和活性失調可以引起人類多種疾病，并可導致“膜聯蛋白病”。目前每種膜聯蛋白的具體生物學功能尚不十分清楚。

2 動脈粥樣硬化(AS)的發生、發展機制

AS及其并發癥是當今世界上導致死亡的最常見的病因之一，是由多種遺傳因素和環境因素共同作用的結果。AS的發生發展包括脂質入侵、血小板活化、內膜損傷、炎性反應、氧化應激、血管平滑肌細胞激活、血栓形成、選擇性基質代謝及血管重建等[7]。AS發病機制有多種假說，但均不能單獨徹底闡明其確切病因及發病機制。

近年來多數學者接受“AS是一種多因素導致的慢性炎癥反應性疾病”的學說，即“炎癥誘發的內皮損傷反應學說”，認為AS形成的基本過程為：在長期高脂血癥的影響下，增多的脂蛋白尤其是氧化修飾的低密度脂蛋白和膽固醇對動脈內膜造成功能性損傷，使內皮細胞和白細胞表面發生特征性改變，粘附分子表達增加，使單核細胞粘附在內皮細胞上的數量增多，并從內皮細胞之間遷移至內膜下成為巨噬細胞，通過清道夫受體吞噬氧化的低密度脂蛋白后，轉化為泡沫細胞，形成最早的粥樣硬化病變脂質條紋，同時平滑肌細胞纖維化增生，促使脂質條紋演變成纖維脂肪病變，最終發展成為纖維斑塊，即AS斑塊，使動脈壁變硬、管腔狹窄[8]。AS發生發展的整個過程都有炎性因素的參與，存在一系列炎癥級聯免疫反應，炎癥細胞尤其是單核細胞與內皮細胞粘附并遷移至內皮下演變為巨噬細胞是AS的關鍵環節之一[9]。

細胞凋亡是AS病變的獨立危險因素，貫穿于AS發生、發展的全過程。細胞凋亡和細胞增殖的平衡決定了AS的進展，其參與了血管內皮的損傷、血栓的形成和平滑肌細胞凋亡后的纖維化所致肌層的增厚、血管重建以及細胞凋亡后AS斑塊的脫落等病理改變。細胞凋亡直接影響粥樣硬化動脈的形態和結構，以及AS斑塊的穩定性。AS斑塊內細胞過度凋亡，在促進不穩定斑塊形成的過程中起著重要的作用[10]。

3 膜聯蛋白與AS的關系

Annexin A1又稱為脂皮素(LipocotinⅠ)、依鈣蛋白(CalpactinⅡ)、磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)抑制蛋白，在機體多數組織尤其是粒細胞、單核細胞中呈強陽性表達。Annexin A1是一個重要的炎癥調控蛋白，在炎性代謝產物產生、中性粒細胞/單核細胞與內皮細胞粘附的過程中起重要作用[11]。在炎癥反應中Annexin A1對中性粒細胞和單核細胞遷移都有強大的抑制效應，這一作用與甲酰基肽受體(FPR)和Lipoxin A4受體(ALXR)的激活、L-選擇素(L-Selectin)的脫落、整合素(Integrin)α4β1的競爭性結合和N-聚糖羧化有關[12]。外源性Annexin A1以及內源性Annexin A1外化與血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)競爭與整合素α4β1結合，抑制單核細胞與血管內皮細胞的粘附，參與早期炎癥反應的調節[13]。Annexin A1的抗炎癥作用還主要體現在它對PLA2的抑制作用，PLA2是炎性介質合成釋放的關鍵酶，是調節炎性反應的中心[14]。Annexin A1也抑制其他一些參與炎癥反應的酶表達和活性，如誘導型一氧化氮合酶和環氧化酶2等[15]。他汀類藥物可以影響外周血單核細胞抗炎蛋白Annexin A1的表達，隨著其劑量增加Annexin A1表達水平顯著增加，發揮其抗炎作用，并進一步發揮抗AS作用。Annexin A1表達的改變能夠影響caspase-3的活化和Ca2+釋放，從而促進細胞凋亡。外源性的Annexin A1可通過提高胞內Ca2+濃度和相關凋亡促進因子的去磷酸化而誘導細胞凋亡[16]。

Annexin A2蛋白主要表達在人體內皮細胞、單核/巨噬細胞、骨髓細胞和某些腫瘤細胞中，在細胞膜構架的形成、膜聚合、內吞和胞吐過程中均起重要作用，還參與多種病理過程。細胞表面的Annexin A2蛋白可作為受體，參與纖溶、細胞粘附、配體介導的信號轉導及病毒感染等生理過程。Annexin A2蛋白在細胞膜表面結合組織纖維蛋白溶解酶原激活因子和纖溶酶原，介導纖溶蛋白酶的生成，增強纖溶酶催化效率，影響凝血機制[17]。通過促進內皮細胞的纖溶活性，降低血液黏稠度及AS的發生率。另外有研究表明，在H2O2或腫瘤壞死因子α(TNF-α)引起的過氧化應激反應中，Annexin A2是胞內應激反應時谷胱甘肽化的主要靶點。Ling等人研究發現Annexin A2的異四聚體還具有還原纖維蛋白溶酶的活性，可通過破壞纖溶酶原中的二硫鍵使其釋放A61片段[18]。AS發展過程中，由于脂蛋白(a)的影響，Annexin A2促纖溶作用減弱；脂蛋白(a)含纖溶酶樣載脂蛋白A，可結合低密度脂蛋白；脂蛋白(a)抑制纖溶酶原結合到Annexin A2分子上，降低纖溶酶產生，導致纖維蛋白溶解障礙，促使進行性AS的發生。同型半胱氨酸可競爭性抑制組織纖維蛋白溶解酶原激活因子與Annexin A2的結合，從而減少纖溶酶的產生，影響正常纖溶而使體內形成血栓[19]。Annexin A2也具有Annexin A1對PLA2的抑制作用而抗炎癥，且四聚體形式的抑制作用更強。

Annexin A5最早由胎盤中分離得到，具有與Annexin A2同樣的抗凝及抗炎癥作用。Annexin A5抗凝功能主要通過有序地排列在細胞膜磷脂表面，形成屏障陣列，遮蓋血液凝固所需的磷脂，并可以從磷脂表面轉移凝血因子。一旦Annexin A5在細胞磷脂膜表面形成的這一屏障被破壞，則容易發生血液凝固。細胞凋亡時細胞膜表面暴露磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)，為血液凝固提供了催化表面，從而加速血栓形成[20]。Annexin A5是抗磷脂抗體所針對的重要自身靶抗原之一，抗磷脂綜合征(APS)血栓形成機制的研究表明，Annexin A5與帶陰離子的磷脂結合，抑制了磷脂依賴凝血復合物的形成，而抗磷脂抗體對Annexin A5的識別，導致Annexin A5與磷脂之間親和力的下降，加速凝血，促進血栓形成[21]。在Ca2+存在的條件下，Annexin A5對PS具有高度親和力，作用位點是第187位的色氨酸。PS從細胞膜的脂雙層內層遷移至外層是細胞凋亡級聯反應的初始事件，利用兩者這種高親和力特性，很多研究者將標記有熒光素(如FITC、PE)或生物素的Annexin A5作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測凋亡細胞的發生[22]，而且利用放射性示蹤技術對Annexin A5進行放射性核素標記后(常用碘或99mTc)，通過與PS的結合可非侵入活體檢測細胞凋亡，用于檢測AS的發生[23]。這個中間物質呈像的技術可以定量反映AS斑塊的組成、代謝及發展趨勢，可早期發現AS的發生，采取措施控制AS的進一步發展。

Annexin A7在體外能聚集嗜鉻顆粒，因而是第一個被分離的膜聯蛋白家族成員。除腎上腺髓質外，已在許多哺乳動物組織中檢測到Annexin A7，包括腦、肝臟、腮腺、脾、肺及骨骼肌。Annexin A7參與膜運輸、細胞分泌、鈣離子動態平衡及腫瘤抑制等多種生物學功能。凋亡發生時，細胞內Annexin A7的含量降低，在凋亡因子刺激下Annexin A7的下調可阻止半乳凝素-3發揮抗凋亡作用[24]。

4 結論

盡管膜聯蛋白具有多種生物學功能，但除Annexin A1在炎癥，Annexin A2在糖尿病中的作用機制，大多具體機制尚不清晰。目前尚無疾病證明直接與特定的膜聯蛋白功能喪失有關，但其必定在多種疾病及病理過程中發揮重要的作用。在AS的發生、發展中，膜聯蛋白很可能參與了多個過程，但需要進行大量的研究來闡明其具體機制。相信這些“老分子”必將成為AS研究領域的“新角色”。

[1]Fatimathas L,Moss SE.Annexins as disease modifiers[J].Histol Histopathol,2010,25(4):527-532.

[2]Monastyrskaya K,Babiychuk EB,Draeger A.The annexins:spatial and temporal coordination of signaling events during cellular stress[J].Cell Mol Life Sci,2009,66(16):2623-2642.

[3]Rescher U,Gerke V.Annexins-unique membrane binding proteins with diverse functions[J].J Cell Sci，2004,117(13):2631-2639.

[4]Talukdar T,Gorecka KM,de Carvalho-Niebel F,et al.Annexins-calcium-and membrane-binding proteins in the plant kingdom:potential role in nodulation and mycorrhization in Medicago truncatula[J].Acta Biochim Pol，2009,56(2):199-210.

[5]Gerke V,Moss SE.Annexins:from structure to function[J].Physiol Rev,2002,82(2):331-371.

[6]Mortimer JC,Laohavisit A,Macpherson N,et al.Annexins:multifunctional components of growth and adaptation[J].J Exp Bot，2008,59(3):533-544.

[7]Libby P,Okamoto Y,Rocha VZ,et al.Inflammation in atherosclerosis:transition from theory to practice[J].Circ J,2010,74(2):213-220.

[8]Rocha VZ,Libby P.Obesity,inflammation,and atherosclerosis[J].Nat Rev Cardiol，2009,6(6):399-409.

[9]Patel S,Celermajer DS,Bao S.Atherosclerosis-underlying inflammatory mechanisms and clinical implications[J].Int J Biochem Cell Biol，2008,40(4):576-580.

[10]Seimon T,Tabas I.Mechanisms and consequences of macrophage apoptosis in atherosclerosis[J].J Lipid Res,2009,50:382-387.

[11]Parente L,Solito E.Annexin 1:more than an anti-phospholipase protein[J].Inflamm Res，2004,53(4):125-132.

[12]Solito E,Romero IA,Marullo S,et al.Annexin 1 binds to U937 monocytic cells and inhibits their adhesion to microvascular endothelium:involvement of the alpha 4 beta 1 integrin[J].J Immunol，2000,165(3):1573-1581.

[13]Araujo LP,Truzzi RR,Mendes GE,et al.Interaction of the Anti-Inflammatory Annexin A1 Protein and Tacrolimus Immunosuppressant in the Renal Function of Rats[J].Am J Nephrol，2010,31(6):527-533.

[14]D'Acquisto F.On the adaptive nature of annexin-A1[J].Curr Opin Pharmacol，2009,9(4):521-528.

[15]Perretti M,D'Acquisto F.Annexin A1 and glucocorticoids as effectors of the resolution of inflammation[J].Nat Rev Immunol，2009,9(1):62-70.

[16]Faiss S,Kastl K,Janshoff A,et al.Formation of irreversibly bound annexin A1 protein domains on POPC/POPS solid supported membranes[J].Biochim Biophys Acta，2008,1778(7-8):1601-1610.

[17]Cockrell E,Espinola RG,McCrae KR.Annexin A2:biology and relevance to the antiphospholipid syndrome[J].Lupus，2008,17(10):943-951.

[18]Ling Q,Jacovina AT,Deora A,et al.Annexin II regulates fibrin homeostasis and neoangiogenesis in vivo[J].J Clin Invest,2004,113(1):38-48.

[19]Sharma MC,Sharma M.The role of annexin II in angiogenesis and tumor progression:a potential therapeutic target[J].Curr Pharm Des，2007,13(35):3568-3575.

[20]Rand JH,Wu XX,Quinn AS,et al.Resistance to annexin A5 anticoagulant activity:a thrombogenic mechanism for the antiphospholipid syndrome[J].Lupus，2008,17(10):922-930.

[21]Laufer EM,Winkens HM,Corsten MF,et al.PET and SPECT imaging of apoptosis in vulnerable atherosclerotic plaques with radiolabeled Annexin A5[J].Q J Nucl Med Mol Imaging，2009,53(1):26-34.

[22]Belhocine TZ,Blankenberg FG.The imaging of apoptosis with the radiolabelled annexin A5:a new tool in translational research[J].Curr Clin Pharmacol，2006,1(2):129-137.

[23]Laufer EM,Reutelingsperger CP,Narula J,et al.Annexin A5:an imaging biomarker of cardiovascular risk[J].Basic Res Cardiol，2008,103(2):95-104.

[24]Torosyan Y,Simakova O,Naga S,et al.Annexin-A7 protects normal prostate cells and induces distinct patterns of RB-associated cytotoxicity in androgen-sensitive and-resistant prostate cancer cells[J].Int J Cancer，2009,125(11):2528-2539.