MYCT-1基因真核表達載體的構建及鑒定

梅 旭,劉 政,邱廣斌

(解放軍202醫(yī)院 檢驗科,遼寧 沈陽 110003)

MYCT-1基因真核表達載體的構建及鑒定

梅 旭,劉 政,邱廣斌*

(解放軍202醫(yī)院 檢驗科,遼寧 沈陽 110003)

目的 構建MYCT-1(myc target)基因真核表達載體,觀察其轉染胃粘膜GES-1細胞系后的表達。方法用RT-PCR法合成MYCT-1 cDNA,克隆至表達載體pcDNA3.1上,測序驗證無突變發(fā)生。將表達載體轉染GES-1細胞,用RT-PCR和Western blot檢測MYCT-1基因的表達。結果限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序證實成功克隆了MYCT-1 cDNA全長并正確插入了表達載體,在GES-1細胞中檢測到MYCT-1mRNA和蛋白。結論成功構建了MYCT-1真核表達載體,可在GES-1細胞中穩(wěn)定表達。

MYCT-1;表達載體;轉染

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1161)

MYCT-1(myc target)基因是我室克隆的一個新基因,曾命名MTLC(myc target from laryngeal carcinoma cells)[1]。研究表明MYCT-1在多種腫瘤組織中表達降低,可能是一個新的抑癌基因[2-5]。為了進一步探討MYCT-1的基因功能及在腫瘤發(fā)生中的可能機制,在本研究中,我們構建了MYCT-1基因的真核表達載體,并將其轉染粘膜GES-1細胞系,以鑒定重組載體表達的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料TRIZOL試劑、RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司),反轉錄酶、Taq酶(Promega公司),Lipofectamin2000脂質(zhì)體轉染試劑盒、pcDNA3.1載體、G418(Invitrogen公司);JM 109菌株、BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司);人胃粘膜細胞系GES-1細胞購自北京腫瘤研究所。抗MYCT-1單克隆抗體由本室自制。

1.2 RT-PCRTRIZOL試劑提取正常胃組織總RNA,用反轉錄酶合成cDNA第一鏈,PCR擴增MYCT-1 cDNA。所用引物序列:正向引物:5′-ATGGATCCCTGCACTGGCTGA TGAGTGTGTA-3′;反向 引物 :5′-GTAAGCTTGAACAGTGCCTTCACCCTCGA GGT-3′。反應條件:95℃預變性1 min,然后以95℃30 s、60℃1min、72℃1.5min進行30個循環(huán),最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.3 載體構建PCR擴增得到的MYCT-1 cDNA片段經(jīng)TA克隆連接到pMD18-T載體上。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒,回收目的片段,克隆到pcDNA 3.1載體上,測序證實無突變發(fā)生。

1.4 細胞轉染接種1.5×105GES-1細胞至35mm培養(yǎng)皿中,以含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)過夜。用Lipofectamin2000將表達載體 pcDNA3.1-MYCT-1及對照質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉染BGC823細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入G418至終濃度5 mg/m l,CO2孵箱孵育過夜。更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,胰酶消化,轉入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 RT-PCR檢測GES-1細胞MYCT-1 mRNA表達TRIZOL試劑提取GES-1細胞總RNA,RT-PCR檢測 MYCT-1 mRNA,正向引物 :5′-GAGTCCATGGCCAGAAAACT-3′;下 游 引 物 :5′-ATGCCTTGATGATGGACTCA-3′,擴增產(chǎn)物長度為504bp,方法同上。

1.6 Western blot檢測GES-1細胞MYCT-1蛋白表達收集1.5×105待檢測的細胞,加入RIPA裂解液,冰上靜置5 min,4℃、12 000 rpm離心30 min,收集上清,電泳、轉膜、封閉,加鼠抗人MYCT-1抗體(1∶1 000),4℃雜交過夜,加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶5 000),雜交2h,將膜浸入ECL工作液中2min,隨后進行壓片檢測,顯影定影,獲取圖像。

2 結果

2.1 RT-PCR結果PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結果為單一條帶,大小約1 000 bp,與預期相符(圖1)。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物電泳結果

圖2 qcDNA3.1-MYCT-1 BamHⅠ/EcoRⅠ酶切產(chǎn)物電泳結果

2.2 重組載體BamH Ⅰ/EcoRⅠ酶切鑒定結果pcDNA3.1-MYCT-1經(jīng)BamH Ⅰ/EcoRⅠ消化得760 bp和4 900 bp兩個片段,酶切產(chǎn)物電泳結果與預期相符(圖2)。

2.3 MYCT-1 mRNA在GES-1細胞中的表達與未轉染細胞和轉染空質(zhì)粒對照細胞相比,轉染pcDNA 3.1-MYCT-1載體的細胞MYCT-1mRNA表達明顯增加(圖3)。

2.4 Western blot結果與未轉染細胞和轉染空質(zhì)粒對照細胞相比,轉染pcDNA3.1-MYCT-1載體的細胞MYCT-1蛋白表達明顯增加(圖4)。

圖3 GES-1細胞MYCT-1 mRNA檢測結果

圖4 W estern b lot結果

3 討論

MYCT-1是我室克隆的一個新基因,為原癌基因c-Myc的一個靶基因。c-Myc是一個含亮氨酸拉鏈的轉錄因子,通過大量靶基因如CAD、ODC 、LDH-A、cyclin E 、M rDb 、telomerase/hTERT 、rcl 、IRP2 、cdc25A 、JPO1可廣泛參與細胞轉化、細胞分化、凋亡及細胞周期調(diào)控[6-7]。研究表明MYCT-1在多種腫瘤組織中表達降低,可能是一個新的抑癌基因。

在前期研究中,我們證實MYCT-1mRNA、蛋白在胃癌組織中表達下調(diào),且在癌旁組織、癌組織及轉移淋巴結組織中依次降低,可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移有關。我們利用 RNA干涉技術將胃粘膜GES-1細胞中MYCT-1基因沉默,發(fā)現(xiàn)MYCT-1表達降低雖然不能直接導致正常胃粘膜細胞惡性轉化,但引起胃癌細胞增殖減慢,凋亡增加,細胞周期S期延長,提示MYCT-1基因的功能可能是抑制細胞DNA合成。

為了進一步探討MYCT-1的基因功能及在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制,在本研究中,我們構建了MYCT-1基因的真核表達載體,并將其成功導入GES-1細胞。結果表明GES-1細胞中檢測到MYCT-1mRNA和蛋白,證實重組載體pcDNA3.1-MYCT-1能夠在GES-1細胞中穩(wěn)定表達。我們將通過研究MYCT-1在GES-1細胞中過表達對細胞的形態(tài)、生長特性、細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等方面的影響,進一步闡明MYCT-1基因在胃癌發(fā)生過程中可能的功能及信號傳導通路。

[1]邱廣斌,賀 光,孫開來,等.6q25區(qū)域一個新基因MYCT-1的克隆及特性分析[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2003,20:94.

[2]Qiu GB,Gong LG,Hao DM,etal.ExpressofMTLC gene in gastric carcinoma[J].World Journalof Gastroenterology,2003,9:2160.

[3]歐陽小明,黃世章,梅開勇.MTLC基因在乳腺癌組織中的表達及其意義[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志,2006,7:21.

[4]劉水平,賀劍鳴.MTLC基因在肝細胞癌及其癌旁肝組織中的表達[J].湘南學院學報(醫(yī)學版),2006,8:16.

[5]邱廣斌,郝冬梅,宮立國,等.MTLC基因在喉癌組織中的低表達及其對喉癌Hep2細胞凋亡的影響[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2005,28:1178.

[6]林 源,劉紹平,羅漢傳,等.VEGF,p53,p21(WAF/CIP1)和 C-myc蛋白表達與肝細胞癌預后關系的研究[J].中國普通外科雜志,2009,18:874.

[7]艾金霞.SBHL對HeLa細胞c-myc,H-ras和hTRT基因表達的研究[J].北華大學學報(自然科學版),2009,10:319.

Construction and identification of an eukariotic expression vector ofMYCT-1

MEIXu,LIU Zheng,QIU Guang-bin.(Departmentof LaboratoryMedicine,No.202Hospital of PLA,Shenyang110003,china)

ObjectiveTo constructan eukariotic expression vectorofMYCT-1 and detectits expression after transfected in GES-1 cells.MethodsMYCT-1 cDNAwas synthetized by RT-PCR and then cloned into an expression vector pcDNA3.1.DNA sequencing was performed to avoid anymutation in recombianant vector.The vector pcDNA3.1-MYCT-1 was transfected intoGES cells by liposome and the expression ofMYCT-1was detected by RT-PCR and Western blot.ResultsThe full length cDNA ofMYCT-1 cloned into the exoression vectorwas identified by restricted enzyme digestion and sequencing.MYCT-1mRNAs and p roteinwere detected in GES-1 cells.ConclusionAn eukariotic efxpression vector of MYCT-1 was ssuccessfully constructed.The reconbinant vector could expressed in GES-1 cells steadily.

MYCT-1;expression vector;transfection

Q784

A

1007-4287(2010)08-1161-02

遼寧省自然科學基金項目(20092084)

*通訊作者

2009-12-23)